Bu video, kalsiyum fosfat aracılı plazmit transfeksiyonu kullanarak insan hücrelerinde influenza psödovirüs üretimini göstermekte ve biyogüvenlik düzeyi 2 koşulları altında antikor nötralizasyon assay'leri gibi sonraki uygulamalar için tek döngülü viral partiküllerin güvenli bir şekilde üretilmesine olanak sağlamaktadır.
Yöntem makalesi
İnsan Hücrelerinde Plazmid Transfeksiyonu Kullanılarak Psödovirüs Üretimi
67 görüntülenme
⸱
31 Ağustos 2026
Bu makalede
Özet
Protokol
1. Kalsiyum-fosfat transfeksiyonu ile psödovirüs paketleme
- Komple DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) besiyerinde HEK293FT hücrelerinin tek hücre süspansiyonlarını (mL başına 9 x 105) hazırlayın (Tablo 1). Tek hücre süspansiyonundan 10 mL'yi bir T75 flask'a ekleyin ve transfeksiyon öncesinde hücreleri 37 °C'de, %5 karbondioksit (CO2) içeren bir inkübatörde 20 sa boyunca inkübe edin.
NOT: HEK293FT düşük pasaj (<20 pasaj) önerilir. Hücre monokatmanının %80-90 konfluens düzeyinde olduğundan emin olun. - Transfeksiyondan 2 saat önce besiyerini, klorokin (100 µM) içeren 10 mL taze komple besiyeri ile değiştirin.
- Reaktifleri ve plazmid DNA'yı Tablo 2 ve Şekil 1'de gösterildiği gibi karıştırın: ddH2O (çift distile su), pCMV/R-HA, pCMV/R-NA, pHR-Luc, pCMV Δ8.9, 2.5 M CaCl2 (kalsiyum klorür) ve 2x 4-(2-hidroksietil)-1-piperazin etansülfonik asit (HEPES) tamponu. Pipetle 5 kez nazikçe aşağı yukarı çekerek karıştırın; karışımı oda sıcaklığında (RT) 20 dakika inkübe edin.
- Karışımı hücrelerin üzerindeki besiyerine aktarın ve flask'ı nazikçe sallayın. Hücreleri hücre inkübatöründe 15 saat inkübe edin.
- Besiyerini 15 mL taze komple DMEM besiyeri ile değiştirin. Hücreleri 37 °C'de, %5 CO2 içeren bir inkübatörde 65 saat inkübe edin.
NOT: Besiyerinin rengi açık turuncu veya hafif sarı olacaktır ve hücrelerin en az %80'i invert ışık mikroskobunda sitopatik etki (CPE) göstermelidir. - Süpernatantı toplayın ve 4 °C'de 20 dakika boyunca 2095 x g hızında santrifüjleyin. Süpernatantı toplayın, alikotlayın ve -80 °C'de saklayın.
Tablo 1: Komple DMEM besiyeri bileşimi.
| Tam DMEM Besiyeri Bileşimi | Konsantrasyon |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | 1x |
| Fetal sığır serumu | 10% |
| Penisilin(1 U/mL)/Streptomisin | 1 μg/ mL |
Tablo 2: Psödovirüs paketleme sistemi.
| Materyaller | Konsantrasyon | Hacim |
| 2x HEPES (pH 7.1) | -- | 675.0 μL |
| CaCl2 (2.5 M) | -- | 67.5 μL |
| ddH2O | -- | 529.2 μL |
| pCMV Δ 8.9 | 1000 ng/μL | 18.9 μL |
| pCMV/R-HA | 100 ng/μL | 27.0 μL |
| pCMV/R-NA | 50 ng/μL | 13.5 μL |
| pHR-Luc | 1000 ng/μL | 18.9 μL |
Sonuçlar
Şekil 1: Kalsiyum aracılı transfeksiyon akış şeması. Bu akış şeması, kalsiyum aracılı transfeksiyonun temel prosedürlerini açıklamak için kullanılır.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Kalsiyum klorür anhidrat | AMRESCO | 1B1110-500G | Reaktif |
| Klorokin difosfat | Selleck | S4157 | Reaktif |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 12100-046 | Reaktif |
| Fetal sığır serumu | Gibco | 16000-044 | Reaktif |
| HEK293FT | Gibco | R700-07 | Hücre hattı |
| HEPES SERBEST ASİT | AMRESCO | 0511-250G | Reaktif |
| HIV-1 p24 antijeni ELISA | ZeptoMetrix | 801111 | Reaktif kiti |
| Lusiferaz analiz sistemi dondurucu paket | Promega | E4530 | Reaktif kiti |
| Mikrosantrifüj tüpleri 1.5 mL | Thermo fisher scientific | 509-GRD-Q | Sarf malzeme |
| Nunc konik santrifüj tüpleri 15 mL | Thermo fisher scientific | 339650 | Sarf malzeme |
| Penisilin-streptomisin | Gibco | 15140-122 | Reaktif |
| Pipet uçları (10 μL) | Thermo fisher scientific | TF102-10-Q | Sarf malzeme |
| Pipet uçları (100 μL) | Thermo fisher scientific | TF113-100-Q | Sarf malzeme |
| Pipet uçları (1000 μL) | Thermo fisher scientific | TF112-1000-Q | Sarf malzeme |
| Serolojik pipetler (5 mL) | Thermo fisher scientific | 170355N | Sarf malzeme |
| Serolojik pipetler (10 mL) | Thermo fisher scientific | 170356N | Sarf malzeme |
