Patates Bitkilerinde Patates Virüsü X Tabanlı mikroRNA Susturma

Bu makalede

Özet

Kaynak: Zhao, J., et al. Potato Virus X Tabanlı mikroRNA Susturma (VbMS) Patateste. J. Vis. Exp. (2020).

Bu video, virüs tabanlı mikroRNA susturma (VbMS) amacıyla, in vitro yetiştirilmiş patates bitkilerine Potato Virus X (PVX) tabanlı bir konstrükt iletmek için Agrobacterium tumefaciens kullanımını göstermektedir. Bu yöntem, bir hedef mikroRNA'nın sistemik olarak baskılanmasını sağlayarak araştırmacıların, gözlemlenebilir fenotipik değişiklikler aracılığıyla bu mikroRNA'nın bitki gelişimi üzerindeki rolünü incelemesine olanak tanır.

Protokol

1. Patates bitkilerinde PVX tabanlı VbMS analizi gerçekleştirin.

4 haftalık in vitro patates bitkilerini toprağa dikin. Dikilen bitkiler 3–4 gün sonra VbMS analizine tabi tutulacaktır.
Patates bitkilerini PVX-STTM (Short Tandem Target Mimic) plazmitlerini içeren Agrobacterium ile inoküle edin.
NOT: Patateste VbMS analizi için, Agrobacterium aracılı infiltrasyon ve kürdanla çizme yoluyla inokulasyon eş zamanlı olarak gerçekleştirilir.
1. PVX-STTM vektörlerini içeren pozitif transformantları seçin ve 50 μg/mL kanamisin ve 50 μg/mL rifampisin içeren 50 mL sıvı LB'ye inoküle edin. OD₆₀ = 1.0 olana kadar 28 °C'deki bir inkübatörde 20 rpm'de 16 saat boyunca büyütün.
2. Aynı zamanda, pozitif Agrobacterium kolonilerini 50 μg/mL kanamisin ve 50 μg/mL rifampisin içeren en az iki yeni LB plağına ekin ve 28 °C'de 1 gün boyunca büyütün. Kontrol olarak PVX-LIC vektörünü ve virüs yayılımını izlemek için PVX-GFP'yi ekleyin.
3. Agrobacterium sıvı kültürünü oda sıcaklığında 3,40 x g santrifügasyon ile 10 dakika boyunca toplayın. Agrobacterium hücrelerini eşit hacimde infiltrasyon tamponu (10 mM MgCl₂, 10 mM MES ve 200 µM asetosingon, pH = 5.6) ile resüspande edin ve OD₆₀ = 1.0'a ayarlayın. Oda sıcaklığında 6 saat inkübe edin.
4. Agrobacterium kültürünü 1 mL'lik iğnesiz bir şırınga ile tam gelişmiş yaprakların abaksiyel yüzeyine infiltre edin.
  1. Bir yaprağı bir elinizle ters çevirip tutun, ardından infiltrasyon bölgesinde yaprak laminasını adaksiyel taraftan desteklemek için bir parmağınızı kullanın. Şırıngayı diğer elinizle yaprak yüzeyine dik tutun ve Agrobacterium kültürünü laminanın abaksiyel yüzeyine infiltre edin.
5. Agrobacterium kültürünü LB plaklarından sıyırın ve infiltre edilen patates bitkilerinin ilk bir veya iki boğum arası gövde yüzeyini bir kürdanla çizin. Gövdenin epidermisini nazikçe çizin. Bitkilere ciddi zarar verebilecek gövdeyi delmekten kaçının.
İnfiltre edilmiş bitkileri bir serada 2 °C'de, 16 saat ışık/8 saat karanlık fotoperiyodunda ve 120 μmol/m²∙ s¹ ışık şiddetinde büyütün.
NOT: miRNA susturulmasıyla ortaya çıkan fenotipler genellikle inokülasyondan sonra 2–4 hafta içinde görülür (Şekil 1, Şekil 2). VbMS fenotipinin infiltrasyondan sonra ortaya çıkması genellikle 10–20 gün sürer. VbMS fenotipi; spesifik miRNA ve hedef genlerin özelliklerine, büyüme koşullarına ve patates çeşitlerine bağlıdır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Şekil 1: Tetraploid patates çeşidi Katahdin'de miR165/16'nın VbMS'si. PVX vektör kontrolü veya PVX-STTM165/16 eksprese eden patates bitkilerinin (Katahdin) fenotipleri. Macenta oklar, yaprak damarlarında ektopik olarak oluşmuş yaprak yapılar...