Adeno-ilişkili Virüsün Retinal Geçirgenliğinin Değerlendirilmesi için Fare Retinal Kriyokesitlerinin Hazırlanması

Bu makalede

Özet

Kaynak: Vacca, O., et al. Using Adeno-associated Virus as a Tool to Study Retinal Barriers in Disease. J. Vis. Exp. (2015)

Bu video, bozulmuş retinal bariyerler boyunca adeno-ilişkili virüs geçirgenliğini görselleştirmek için fare retinal kriyokesitlerinin hazırlanmasına yönelik adım adım prosedürü göstermektedir.

Protokol

Hayvan örneklerini içeren tüm prosedürler, ilgili hayvan etik kurul tarafından incelenmiş ve onaylanmıştır.

Retinal kriyokesitler için (Şekil 1), enükle edilmiş gözleri lens ve korneayı çıkarmak için disseke edin ve %4 paraformaldehit içinde 1 saat boyunca imersiyon fiksasyonuna tabi tutun.
1. Önceden fikse edilmiş gözleri oda sıcaklığında 1 saat boyunca %10 sakkarozda, ardından oda sıcaklığında bir saat daha %20 sakkarozda kriyoprotekte edin. %30 sakkaroz çözeltisinde, 4 °C'de gece boyunca kriyoproteksiyon uygulayın. Göz çukurlarını Cryo-matrix gibi bir gömme rezinine dondurarak gömün. 10 µm kalınlığında kriyokesitler hazırlayın ve bunları donmuş doku kesitleri için özel olarak işlem görmüş ve boyama sırasında doku yapışmasını artıran lamlara monte edin.
2. Kesitleri pH 7.4 fosfat tamponlu salin (PBS) içindeki %0.1 Triton X-100 ile 5 dakika boyunca permeabilize edin. PBS ile 2 kez yıkayın ve %1 sığır serum albümini (BSA) ve %0.1 Tween 20 içeren PBS içinde oda sıcaklığında 1 saat boyunca bloklayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Şekil 1: Genel protokolün şematik gösterimi. Adeno-ilişkili virüs (AAV) üretiminden sonra, anestezi uygulanmış yetişkin farelerin vitreusuna veya penis venine partiküller enjekte edilir. Yeşil floresan protein (GFP) ekspresyonunu takip etmek ...