Bu video, bozulmuş retinal bariyerler boyunca adeno-ilişkili virüs geçirgenliğini görselleştirmek için fare retinal kriyokesitlerinin hazırlanmasına yönelik adım adım prosedürü göstermektedir.
Yöntem makalesi
Adeno-ilişkili Virüsün Retinal Geçirgenliğinin Değerlendirilmesi için Fare Retinal Kriyokesitlerinin Hazırlanması
62 görüntülenme
⸱
31 Ağustos 2026
Bu makalede
Özet
Protokol
Hayvan örneklerini içeren tüm prosedürler, ilgili hayvan etik kurul tarafından incelenmiş ve onaylanmıştır.
- Retinal kriyokesitler için (Şekil 1), enükle edilmiş gözleri lens ve korneayı çıkarmak için disseke edin ve %4 paraformaldehit içinde 1 saat boyunca imersiyon fiksasyonuna tabi tutun.
- Önceden fikse edilmiş gözleri oda sıcaklığında 1 saat boyunca %10 sakkarozda, ardından oda sıcaklığında bir saat daha %20 sakkarozda kriyoprotekte edin. %30 sakkaroz çözeltisinde, 4 °C'de gece boyunca kriyoproteksiyon uygulayın. Göz çukurlarını Cryo-matrix gibi bir gömme rezinine dondurarak gömün. 10 µm kalınlığında kriyokesitler hazırlayın ve bunları donmuş doku kesitleri için özel olarak işlem görmüş ve boyama sırasında doku yapışmasını artıran lamlara monte edin.
- Kesitleri pH 7.4 fosfat tamponlu salin (PBS) içindeki %0.1 Triton X-100 ile 5 dakika boyunca permeabilize edin. PBS ile 2 kez yıkayın ve %1 sığır serum albümini (BSA) ve %0.1 Tween 20 içeren PBS içinde oda sıcaklığında 1 saat boyunca bloklayın.
Sonuçlar
Şekil 1: Genel protokolün şematik gösterimi. Adeno-ilişkili virüs (AAV) üretiminden sonra, anestezi uygulanmış yetişkin farelerin vitreusuna veya penis venine partiküller enjekte edilir. Yeşil floresan protein (GFP) ekspresyonunu takip etmek için Micron III kamera ile fundus görüntüleme yapılır. GFP ekspresyon paterni, immünohistokimya ve konfokal görüntüler sayesinde retinal kriyokesitler ve flatmount retinalar üzerinde analiz edilir. Kan dolaşımında AAV partiküllerinin varlığının bir göstergesi olan GFP dizisinin varlığını tespit etmek amacıyla, intravitreal veya intraperitonal enjeksiyon yapılan farelerden alınan kan örneklerinde polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) analizi ile AAV'nin kan-retina bariyerini (BRB) geçişi değerlendirilir.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Cryomatrix gömme reçinesi | Thermo Scientific | 6769006 | |
| Superfrost plus yapışkan lamlar | Thermo Scientific | 10143352 | |
| Binoküler büyüteç SZ76 | ADVILAB | ADV-76B2 | Standlı epi ve dia LED'li 0.66 x 5 zum / Retina diseksiyonu |
| Düz yaylı makas - 8.5 cm | Bionic France S.a.r.l | 15003-08 | Retina diseksiyonu |
