Bu video, transgenik bir fare retinasında AAV aracılı gen aktarımı yöntemini ve ardından iç sınırlayıcı membran bütünlüğünü değerlendirmek için yapılan doku diseksiyonu ve boyama işlemlerini göstermektedir.
Yöntem makalesi
Bozulmuş Retinal Membran Bütünlüğünün Görselleştirilmesi için AAV Aracılı Gen Aktarımı
10 görüntüleme
⸱
31 Ağustos 2026
Bu makalede
Özet
Protokol
Hayvan örneklerini içeren tüm prosedürler, ilgili hayvan etik inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır.
1. İmmünohistokimya
- Retinal düz montlar (Şekil 1) için, diseksiyonu kolaylaştırmak amacıyla enükle edilmiş gözleri %4 paraformaldehitte 15 dk sabitleyin.
- 15-30 dk içinde, kornea ve lensi çıkarmak için gözleri diseke edin. Ora serrata ve optik sinir çevresinden keserek retinayı, retinal pigment epitelyumundan (RPE) ve skleradan ayırın. Retinayı ve transduce edilmiş retinal hücrelerdeki floresan proteini sabitlemek için %4 paraformaldehitte 30 dk daha bekletin (sabitleme 24 saati geçmemelidir). Steril PBS, pH 7.4 ile 5 dk yıkayın.
- Fosfat tamponlu salini (PBS), bloklama tamponu (%1 sığır serum albumini (BSA), %2 normal keçi veya eşek serumu, %0.5 Triton X-100 içeren PBS) ile değiştirin ve bloklama tamponunda oda sıcaklığında 4 saat veya 4 °C'de gece boyunca inkübe edin.
- Dokuları, bir bloklama tamponu içinde primer antikorlarla oda sıcaklığında 4 saat veya 4 °C'de gece boyunca inkübe edin. PBS ile 3x yıkayın.
NOT: Kullanılan antikorlar şunlardır: ILM'yi (iç sınırlayıcı membranlar) işaretleyen anti-laminin (1/1,000), çubuk hücrelerini işaretleyen anti-rhodopsin klon 4D2 (1/500), Müller hücrelerini işaretleyen anti-glutamine synthetase klon GS-6 (1/1,500), koni hücrelerini işaretleyen Peanut agglutinin (PNA) Lektin (1/40). - Dokuları, bloklama tamponu içinde 1:500 dilüsyonundaki alexa fluor konjuge ikincil antikorlarla oda sıcaklığında ve ışıktan korunarak 1 saat (kryokesitler) veya 2 saat (düz montlar) inkübe edin. PBS ile 3x yıkayın.
- Retinaya rahatlatıcı kesikler atın ve fotoreseptör veya retinal ganglion hücresi (RGC) tarafı yukarı bakacak şekilde bir lam üzerine düz montlayın. Sulu montlama medyumu ekleyin, lameli kapatın ve 4 °C'de saklayın.
- Lazer taramalı konfokal mikroskop ile konfokal mikroskopi yapın. Eksitasyon ve emisyon çapraz etkileşimini (crosstalk) azaltmak için görüntüleri ardışık olarak, satır satır elde edin. Adım boyutunu Nyquist–Shannon örnekleme teoremine göre belirleyin. Final görüntülerde aşırı doygun pikselleri minimize eden pozlama ayarlarını kullanın. 12-bit görüntüleri FIJI ile işleyin, Z-project fonksiyonu altında maksimum yoğunluk kullanarak Z-kesitlerini tek bir düzleme projekte edin ve son olarak 8-bit RGB renk moduna dönüştürün.
Sonuçlar
Şekil 1: Genel protokolün şematik gösterimi. AAV üretiminden sonra, anestezi altındaki yetişkin farelerin vitreusuna veya penis venine partiküller enjekte edilir. GFP (Yeşil floresan protein) ekspresyonunu takip etmek için Micron III kamera ile fundus görüntüleri alınır. GFP ekspresyon paterni, immünohistokimya ve konfokal görüntüler sayesinde retinal kriyokesitlerde ve düzleştirilmiş (flat-mount) retinalarda analiz edilir. BRB'den AAV geçişi, kan dolaşımındaki AAV partiküllerinin bir göstergesi olan GFP sekansının varlığını tespit etmek amacıyla, intravitreal veya intrapenal olarak enjekte edilen farelerden alınan kan örnekleri üzerinde PCR analizi ile değerlendirilir.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Superfrost Plus Adhesion Slides | Thermo Scientific | 10143352 | Lamlar |
| Anti-laminin | Sigma | L9393 | Antikor |
| Anti-rhodopsin clone 4D2 | Millipore | MABN15 | Antikor |
| Anti-glutamine synthetase clone GS-6 | Millipore | MAB302 | Antikor |
| Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein | Dako | 334 | Antikor |
| PNA Lectin | Invitrogen | L32459 | Prob |
| Alexa fluor konjuge ikincil antikorlar | Invitrogen | Antikor | |
| Fluorsave reaktifi | Calbiochem | 345789 | Kapatma medyumu |
| Evans Blue boyası | Sigma | E2129 | Boya |
| Formamide spectrophotometric | Sigma | 295876-2L | |
| Fluorescein | Sigma | F2456 | Boya |
| Micron III | Phoenix Research Labs | 3-CCD renkli kamera, frame grabber ve hazır yazılım tabanlı mikroskopi sistemi; araştırmacıların fare retinalarını görüntülemesini sağlar. | |
| Binocular magnifier SZ76 | ADVILAB | ADV-76B2 | Standlı epi ve dia LED'li 0,66 x 5 zum / Retina diseksiyonu |
| Spring scissors straight - 8.5 cm | Bionic France S.a.r.l | 15003-08 | Retinal diseksiyon |
