Rekombinant Hepatit B Virüs Partiküllerinin Üretimi ve Saflaştırılması

Özet

Kaynak: Nishitsuji, H., et al. Development of a Hepatitis B Virus Reporter System to Monitor the Early Stages of the Replication Cycle. J. Vis. Exp. (2017)

Bu video, erken enfeksiyon olaylarının incelenmesi ve yüksek kapasiteli antiviral ilaç tarama uygulamaları için güvenli, replikasyon yeteneği olmayan viral preparasyonların hazırlanmasına olanak tanıyan rekombinant Hepatit B virüsü partiküllerinin üretimini ve saflaştırılmasını göstermektedir.

Protokol

1. Reporter Proteini Kodlayan Rekombinant HBV (Hepatit B Virüsü) Üretimi

1. HepG2 hücrelerinin hazırlanması
   1. Hücre kültürü ortamını hazırlayın (%10 fetal bovine serum (FBS), 10 U/ml penisilin, 10 µg/ml streptomisin ve 10 U/ml esansiyel olmayan amino asitler ile desteklenmiş Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM)).
   2. Transfeksiyondan bir gün önce, 4 x 10⁶ HepG2 (İnsan Hepatosellüler Karsinom G2) hücresini 10 ml kültür ortamı içeren 10 cm'lik kolajen kaplı bir kaba ekleyin. HepG2 hücrelerini nemlendirilmiş %5 CO₂ inkübatöründe 37 °C'de inkübe edin.
      NOT: Yaklaşık 4 x 10⁶ HepG2 hücresi 10 ml kültür ortamında 10 cm'lik kolajen kaplı bir kaba ekildiğinde, ertesi gün %70-90 konfluense ulaşacaktır.
2. Transfeksiyon
   1. HepG2 hücrelerini, üretici talimatlarına uygun bir transfeksiyon reaktifi kullanarak 5 µg pUC1.2HBV delta epsilon15 (epsilon dizisinde delesyonu olan bir HBV replikasyon plazmidi) ve 5 µg pUC1.2HBV/NL15 ile transfekte edin.
   2. Ertesi gün, kültür ortamını uzaklaştırın ve 10 ml taze kültür ortamı ekleyin.
   3. Transfeksiyondan bir hafta sonra, rekombinant HBV içeren kültür ortamını 50 ml'lik bir tüpe aktarın ve 1.3. adımına geçin. Transfekte edilmiş hücreleri içeren kaba 10 ml taze kültür ortamı ekleyin.
      NOT: Rekombinant HBV üretimi 4 hafta boyunca sürdürülür. Rekombinant HBV içeren kültür ortamı 4 °C'de 1 ay boyunca saklanabilir.
3. Rekombinant HBV'nin saflaştırılması
   1. Rekombinant HBV içeren kültür ortamındaki hücre kalıntılarını santrifüjle (2,30 x g'de 5 dakika) uzaklaştırın.
   2. Süpernatantı 0,45 µm'lik bir membran filtreden geçirin.
   3. Rekombinant HBV içeren kültür ortamına, eşit hacimde %26 PEG/1,5 M NaCl (50 ml içinde 130 g polietilen glikol 60, 49 g NaCl (sodyum klorür), 1 ml 0,5 M EDTA (Etilendiamintetraasetik asit) pH 8,0 ve 5 ml 1 M HEPES (N-2-hidroksietilpiperazin-N'-2-etansülfonik asit) pH 7,6) ekleyin ve nazikçe karıştırın. 4 °C'de gece boyunca inkübe edin.
   4. 4 °C'de 2,30 x g'de 20 dakika santrifüjleyin.
   5. Süpernatantı atın ve peleti 0,5 ml TNE (10 mM Tris, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA) içinde çözün.
   6. Kalıntıları 2,30 x g'de 5 dakika santrifüjleyerek uzaklaştırın.
   7. Rekombinant HBV içeren 0,5 ml TNE'yi, TNE içindeki 0,8 ml %20 sakroz üzerine yükleyin.
   8. 15 °C'de 100,0 × g'de 3 saat santrifüjleyin.
   9. Süpernatantın mümkün olduğunca fazlasını atın ve peleti saklayın. Peleti, her 40 ml başlangıç kültür ortamı için 1 ml serumsuz DMEM içinde yeniden süspande edin.
   10. 4 °C'de gece boyunca inkübe edin.
   11. 0,45 µm'lik bir filtreden süzün. 0,5 ml'lik alikotlar hazırlayın ve -80 °C'de saklayın.
       NOT: Orijinal virüs örneğinde rapor protein kontaminasyonu gözlemlenirse, virüsü TNE içindeki %5-30 sakroz ile 10,00 x g'de 2 saat boyunca yoğunluk gradyanı ultra-santrifüjle veya 1,1-1,6 g/ml aralığında 150,0 x g'de 50 saat boyunca CsCl (sezyum klorür) yoğunluk dengeli santrifüjle saflaştırın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Nano-Glo Lusiferaz Analiz Reaktifi	Promega	N10
Penisilin-Streptomisin Karışık Çözeltisi	Nacalai Tesque	09367-34
DMEM	Thermo Fisher Scientific	11995065
10 mm'lik/kolajen kaplı kap	Iwaki	4020-010
Lipofectamine 30 Transfeksiyon Reajeni	Thermo Fisher Scientific	L3001
Polietilen glikol (PEG) 60	Sigma-Aldrich	81255
Polietilenglikol (PEG) 80	Sigma-Aldrich	89510
NaCl	Nacalai tesque	31319-45
0,5 mol/L EDTA Çözeltisi	Nacalai tesque	06894-14
Tris-HCl	Nacalai tesque	35434-21
Millex-HP, 0.45 μmpolieter sülfon, filtre	Merck Millipore	SLHP033RS
Dimetil sülfoksit (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650
Kolajen kaplı 96 kuyucuklu plaka	Corning	NO3585
HepG2-NTCP1-myc-klon2	-	-
pUC1.2HBV delta epsilon	-	-
pUC1.2HBV/NL	-	-