Bu video, sivrisinek larvalarındaki belirli genleri susturmak için mikroRNA kodlayan rekombinant sivrisinek densovirüslerinin kullanımını göstermektedir. Enfekte erken dönem larvalar, sonraki çalışmalar için hedef gen ekspresyonunu baskılayan fonksiyonel mikroRNA'lar üretir.
Yöntem makalesi
Sivrisinek Larvalarında Rekombinant Densovirus Aracılı Gen Susturma
13 görüntüleme
⸱
31 Ağustos 2026
Bu makalede
Özet
Protokol
1. Sivrisinek Transdüksiyonu
- 100 adet 1. instar Aedes albopictus larvasını deiyonize su kullanarak üç kez yıkayın ve ardından larvaları 95 mL deiyonize su içeren bir behere aktarın. 5 mL rekombinant Aedes aegypti densoviru (rAaeDV) stok ekleyin (final konsantrasyonu 1.00 x 1010 copies/mL).
- 28 °C'de 24 h boyunca inkübe edin, larvaları deiyonize su kullanarak üç kez yıkayın ve ardından larvaları tekrar plakalara aktarıp düzenli olarak besleyin.
- Larvalardaki hedef gen ekspresyon seviyesini qPCR veya Western blot ile izleyin.
NOT: Enfekte larvaları daha hassas bir şekilde izole etmek için floresan sinyal tespit yöntemi kullanılabilir. Örneğin, DsRed eksprese eden rekombinant virüs ile enfekte olmuş larvalardan gelen floresan sinyalleri tespit etmek için, larvalar bir konkav lam üzerine yerleştirilebilir ve enfeksiyondan sonraki 2 gün boyunca her 8 h'de bir ters floresan mikroskobu altında gözlemlenebilir. Floresan larvalar tespit edildiğinde, sonraki sürekli gözlemlere olanak sağlamak için her biri ayrı plastik test kaplarına ayrılmalıdır. Birden fazla dokusu enfekte olmuş larvalar bu yöntemle tanımlanabilir.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Santrifüj cihazı | Thermo Scientific | 75004260 | |
| Santrifüj Sistemi | Beckman Coulter | 363118 | |
| SuperReal PreMix Plus (SYBR Green) | Beijing Tiangen Biotech | FP205 |
