Transmisyon Elektron Mikroskobu Kullanılarak Isıl İşlem Uygulanmış Viral Kapsidlerin Görüntülenmesi

Özet

Kaynak: Moore, M. D., et al. Alternative In Vitro Methods for the Determination of Viral Capsid Structural Integrity. J. Vis. Exp.(2017).

Bu video, yapısal değişiklikleri ve ısı kaynaklı hasarları ortaya çıkarmak amacıyla, saflaştırılmış viral kapsidlerin nasıl ısıtıldığını, hazırlandığını ve transmisyon elektron mikroskobu (TEM) kullanılarak nasıl görüntülendiğini göstermektedir.

Protokol

1. TEM Numune Hazırlama
   1. TEM için tasarlanmış karbon destekli film (nikel) ızgaraları temin edin.
      NOT: Tesis mikroskobunda kullanılacak önerilen reaktifler ve bunların kullanımı hakkında merkez tesiste danışın. Nemle teması en aza indirmek için ızgaraları kurutucu içeren bir kutuda veya vakum odasında sakladığınızdan emin olun.
   2. Yaklaşık 5 cm x 5 cm boyutunda filtre kağıdı parçaları kesin. Cam Petri kapları ve mikroskopi kullanımına uygun, kendiliğinden kapanan ters cımbızlar temin edin.
   3. Yaklaşık 2,5 cm x 5 cm boyutunda bir parafin film parçası kesin. Tezgah üzerine yerleştirin.
   4. Norovirüs GII.4 Sydney kapsidlerinin ısıtma işlemi
      1. Kapsidlere monte edilmiş, saflaştırılmış insan norovirüs ana kapsid proteini (VP1) GII.4 Sydney (Erişim: JX459908) temin edin. 
         NOT: Çalışmadaki kapsidler, R. Atmar'ın (Baylor College of Medicine, Houston, TX) nezaketiyle temin edilmiştir.
      2. Kapsidleri, tekli kapaklı polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) tüplerinde maksimum 15 µL hacme ulaşacak şekilde 10 mM 4-(2-hidroksietil)-1-piperazinetansülfondik asit (HEPES) (pH 7,4) ile seyreltin. Tüpün en az 600 ng kapsid içerdiğinden emin olun. Her bir işlem-ligand kombinasyonu için 600 ng kapsid olduğundan emin olun.
      3. Termal döngüleyiciyi istenen ısıtma işlemine göre ön ısıtmaya tabi tutun. 
         NOT: Bu protokol için, farklı sürelerde (0 - 25 dk) 68 °C'de işlem yapılması seçilmiştir.
      4. Hızlı soğutma için ek bir termal döngüleyiciyi 4 °C'ye ön ısıtmaya tabi tutun. Kapsid solüsyonu içeren tüpleri istenen süre boyunca termal döngüleyiciye yerleştirin. Isıtma işleminin ardından hemen 5 dk boyunca önceden soğutulmuş 4 °C'lik döngüleyiciye aktarın.
      5. Tüm damlacıkların tüpün dibine çökmesi için santrifüjde kısa süreli olarak döndürün.
      6. İşlem görmüş kapsid solüsyonunun tamamını (~15 µL damla şeklinde) parafin film üzerine pipetleyin.
   5. Izgara kenarını cımbızla tutun, cımbızın kenarı kapatarak ızgarayı kavramasını sağlayın ve ızgarayı karbon tarafı aşağı gelecek şekilde işlem görmüş solüsyon damlasının üzerine yerleştirin. Kapsidin ızgaraya tutunması için 10 dk boyunca inkübe edin.
      1. Kapsid preparasyonunun saflığına bağlı olarak, gerekirse işlem görmüş kapsid damlacığının arkasına sıralı şekilde yerleştirilmiş 10-15 µL damlacıklar halinde 10 mM HEPES solüsyonu ile yıkamalar ekleyin.
      2. 10 dk sonra, ızgarayı damlacıkla birlikte kaldırın. Damlacığı emdirerek uzaklaştırmak için ızgarayı bir filtre kağıdı parçasına neredeyse dik şekilde yerleştirin. 10 - 15 µL HEPES tamponu damlacığını ızgarayla birlikte kaldırın, 30 s boyunca bekletin ve ardından yıkamak için başka bir filtre kağıdı parçasıyla emdirerek uzaklaştırın.
   6. Parafin filmin boş bir alanına 15 µL boyutunda %2'lik uranil asetat solüsyonu damlası yerleştirin.
      1. Uranil asetat damlasını ızgarayla birlikte kaldırın ve 45 s boyunca bekletin. Solüsyonun çoğunun giderildiğinden emin olarak uranil asetatı emdirerek uzaklaştırın. Izgarayı, cımbız üzerindeki neme "yapışmamasına" dikkat ederek, karbon tarafı yukarı bakacak şekilde bir filtre kağıdı parçası üzerine yerleştirin. Üzerinde ızgara bulunan filtre kağıdını açık bir cam Petri kabına yerleştirin.
         NOT: Plastik Petri kapları kullanmayın, çünkü ızgaralar bunlara elektrostatik olarak çekilecek ve kaba yapışacaktır.
   7. Tüm işlemler için tekrarlayın. TEM ile gözlemlemeden önce kuruması için ızgaraların bulunduğu Petri kabı yarılarını gece boyunca bir desikatörde bekletin.
   8. Hazırlanan ızgaraların gözlemlenmesiyle ilgili olarak ilgili kurumdaki mikroskopi tesisiyle iletişime geçin. Bazı tesisler, kullanıcının tesisin cihazının kullanımı konusunda eğitilmesine izin vermektedir. Belirli bir mikroskobun kurulumu ve gözlemlenmesine ilişkin spesifik ayrıntılar bu makalenin kapsamı dışındadır.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Transmisyon elektron mikroskobu numune hazırlama
Karbon destekli filme sahip nikel elektron mikroskobu ızgaraları	Ladd Araştırma	10880-100
Kendinden kapanan ters elektron mikroskobu cımbızları	Ted Pella	5372-NM
Kalitatif filtre kağıdı	Sigma-Aldrich (Whatman)	WHA1002055
Cam petri kapları	Sigma-Aldrich	BR455743
100 mM stok HEPES çözeltisi (pH 7,2)	Metin bulunmamaktadır.	Söz konusu metin bulunmamaktadır.
%2'lik uranil asetat	İlgili içerik bulunmamaktadır.	S/A