Spiroket Bakterilerde Bakteriyofaj Aracılı Gen Aktarımı

Özet

Kaynak: Eggers, C. H. Lyme Hastalığı Spiroket Borrelia burgdorferi'nin Faj Aracılı Genetik Manipülasyonu. J. Vis. Exp. (202). Bu video, kanamisin-direnç plazmidi taşıyan, polietilen glikol ile çöktürülmüş, bulaşıcı olmayan bakteriyofajlar kullanılarak genetiği değiştirilmiş Borrelia spiroketlerinin transduksiyonunu göstermektedir. Bakterilerle inkübasyonun ardından, kültür antibiyotik takviyeli besiyerine ekilir. Yalnızca plazmidi alan hücreler hayatta kalır ve koloni oluşturur. Bu koloniler daha sonra seçilir ve sonraki uygulamalar için stabil, plazmit taşıyan bir bakteri popülasyonu oluşturmak amacıyla antibiyotik içeren sıvı besiyerinde genişletilir. Eggers, C. H. Lyme Hastalığı Spiroketinin Faj Aracılı Genetik Manipülasyonu Borrelia burgdorferi. J. Vis. Exp.. (2022).

Bu video, kanamisin dirençli bir plazmid taşıyan, polietilen glikol ile çöktürülmüş, enfeksiyöz olmayan bakteriyofajlar kullanılarak genetik olarak modifiye edilmiş Borrelia spiroketlerinin transdüksiyonunu göstermektedir. Bakterilerle inkübasyonun ardından, kültür antibiyotik destekli besiyerine ekilir. Yalnızca plazmidi alan hücreler hayatta kalır ve koloniler oluşturur. Bu koloniler daha sonra, sonraki uygulamalar için stabil, plazmid taşıyan bir bakteriyel popülasyon oluşturmak amacıyla antibiyotik içeren sıvı besiyerinde seçilir ve genişletilir

Protokol

1.Bakteriyofaj φBB-1'in PEG (polietilen glikol) çöktürmesinin ardından transdüksiyon deneyi

1. Transduksiyon deneylerinde alıcı olarak kullanılacak B. burgdorferi kültürlerini hazırlayın. Belirlenen yoğunluğa göre, 15 mL'de 1 × 107 spirochet·mL−1 elde etmek için gereken alıcı kültür hacmini hesaplayın.
2. Bu kültür hacmini 6.0 x g'de 10 dk boyunca santrifüjleyin. Süpernatantı dökün ve peleti 14,5 mL taze BSK (Barbour-Stoenner-Kelly) içinde yeniden süspande edin.
3. Alıcı klon kültürüne ≤50 µL PEG ile çöktürülmüş fage örneği ekleyin. İyice karıştırın ve 3 °C'de 72-96 sa boyunca inkübe edin.
   NOT: PEG çöktürmesi sırasında geri kazanılan fage miktarı, bir dizi faktöre bağlı olarak değişkenlik gösterebilir. Ancak, indüklenmiş B. burgdorferi suşu CA-11.2A'nın 15 mL'lik bir kültüründen elde edilen 50 µL, tipik olarak 50-1.0 canlı fage içerir. ≥50 µL'lik fage geri kazanım hacimleri, muhtemelen SM (Süspansiyon Ortamı) ile BSK arasındaki artan oran nedeniyle B. burgdorferi büyümesini olumsuz etkiler.
4. PEG ile çöktürülmüş fage ile karıştırdıktan sonra, katı faz ekimi ile transdükantların seleksiyonunu gerçekleştirin.

2. Transduktanların seçimi

NOT: Potansiyel transduktantların katı fazda ekimi, protokolün tek katmanlı bir modifikasyonu kullanılarak gerçekleştirilir. B. burgdorferi kolonileri agar içerisinde büyüdüğünden, katı faz ekimi yoluyla transduktant seçimi için örnekler, plaklar dökülürken medyuma eklenmelidir. Bu teknik de transduktant seçimi için etkili olabilir, ancak henüz bu amaçla denenmemiştir.

1. Plaklara dökülecek transdüksiyon deneyleri ve kontrollerinden gelen örnek sayısına göre, transdüksiyonların seçimi için gereken plak sayısını belirleyin.
   NOT: Tipik olarak, örnek başına iki plak dökülür; bunlardan biri kültür hacminin yaklaşık %10'una eşdeğerdir ve diğeri kültürün geri kalanını içerir. Ayrıca, donör ve resipiyent olarak kullanılan faj preparasyonunun ve/veya ata klonların seçim sırasında kullanılan antibiyotiklerin varlığında büyümediğini tek tek test etmek için negatif kontrol olarak hizmet eden plaklar dökün. En az iki ekstra plak için plaklama materyali hazırlamanız da önerilir. Örneğin, dökülecek örnek ve kontrol sayısı sekiz ise, 10 plak için yeterli plaklama karışımı hazırlayın.
2. Plaklama çözeltilerini aşağıda açıklandığı şekilde hazırlayın.
   NOT: Her plak, plaklama için 20 mL 1.5x BSK ve 10 mL %2,1 agarozdan (2:1 oranında) oluşan toplam 30 mL olacaktır. Bu, nihai konsantrasyonları 1x BSK ve %0,7 agaroz olan bir plak sağlayacaktır. Örneğin, 10 plak için, 200 mL 1.5x BSK ve 10 mL %2,1 agarozdan oluşan toplam 30 mL'lik bir plaklama karışımı hazırlayın.
   1. 1.5x BSK için listelenen her bir bileşen miktarlarını kullanarak 1 L 1.5x BSK hazırlayın. 1x BSK için açıklandığı şekilde saklayın.
   2. Su içinde %2,1 agaroz hazırlayın ve otoklavlayın. Agaroz çözeltisini taze kullanın veya oda sıcaklığında saklayın. Oda sıcaklığında saklandıysa, plaklamadan önce tamamen eriyene kadar kapağı gevşekçe kapalı şekilde mikrodalgada ısıtın.
   3. Tüm plaklama karışımına dayanarak, uygun konsantrasyonu elde etmek için gereken antibiyotik hacmini belirleyin.
      NOT: Nihai plaklama çözeltisinin toplam hacmi 30 mL ise, 20 mL 1.5x BSK ve tüm 30 mL'nin doğru nihai antibiyotik konsantrasyonuna sahip olmasını sağlayacak miktarda antibiyotiği karıştırın. Transdüksiyon deneyindeki donör ve resipiyentin her ikisi de farklı antibiyotik direnç genlerine sahipse, plaklama karışımı her iki antibiyotiği de içermelidir. Donörden gelen PEG-presipite faj bir antibiyotik direnç belirteci kodluyorsa ve resipiyente ait böyle bir belirteç yoksa, plaklama karışımı yalnızca tek bir antibiyotik içermelidir.
3. Dökülecek plak sayısına göre, uygun miktarda 1.5x BSK ve antibiyotiği, tüm plaklama karışımını alabilecek büyüklükte steril bir şişeye aktarın. 56 °C'deki su banyosunda ≥15 dk boyunca dengeleyin.
4. Otoklavdan veya mikrodalgadan çıkan erimiş agarozu 56 °C'lik su banyosunda ≥15 dk boyunca dengeleyin.
5. Dengelemeden sonra, belirlenen miktarda %2,1 agarozu 1.5x BSK (antibiyotikli) içeren şişeye ekleyin ve plaklama çözeltisini 42 °C'deki su banyosuna 10-15 dk boyunca geri koyun.
   NOTE: Daha yüksek sıcaklıklar spiroketlere zarar verebilir veya onları öldürebilir36. Yukarıdakinin aynısı olan su banyosu kullanılıyorsa, dengeleme zamanlayıcısını başlatmadan önce su banyosunu 42-45 °C'ye soğutun. Plaklama çözeltisinin 42 °C'de 20 dakikadan fazla dengelenmesine izin vermeyin, aksi takdirde plaklar dökülürken katılaşmaya başlayacaktır.
6. Dengelenme sırasında, plaklanacak B. burgdorferi örneklerini hazırlayın. Plaklanacak miktarı steril bir 50 mL konik santrifüj tüpüne aktarın.
7. 1,5 mL'den daha az bir miktar (%30 mL'lik nihai plak hacminin <%5'i) plaklanacaksa, örneği yeni tüpe aktarın ve plaklama sırasında plaklama karışımını doğrudan örneğe ekleyin.
   1. Daha büyük hacimler için, kültürün istenen hacmini yeni tüpe aktarın ve ardından oda sıcaklığında 10 dk boyunca 6.0 x g'de santrifüjleyin. Süpernatantın 10-50 µL'si hariç tümünü dökün ve kalanı, plaklamadan önce pelleti tamamen yeniden süspanse etmek için kullanın.
   2. Ko-kültür sonrası kontrol plakları için, donör veya resipiyent klonların ≥10⁷ hücresini steril 50 mL konik santrifüj tüplerine ekleyin. Hacim 1,5 mL'nin üzerindeyse, santrifüjleyin ve pelleti yeniden süspanse edin. PEG-presipite faj kullanılarak bir transdüksiyon deneyi yapıldıysa, resipiyent klona ek olarak, plaklama için 10-250 µL faj örneğini steril bir 50 mL konik tüpe ekleyin.
8. Plaklama çözeltisi 42-45 °C'de 10-15 dk boyunca dengelendikten sonra, 30 mL plaklama çözeltisini uygun örneğin bulunduğu tüpe aktarın; plaklama karışımını ve örneği hemen etiketli bir plağa dağıtın. Plaklanacak her örnek için yeni bir pipetle işlemi tekrarlayın.
9. Plakların 15-20 dk boyunca katılaşmasına izin verin ve ardından %5 CO₂ ile desteklenmiş 33 °C'lik bir inkübatöre yerleştirin. Plakları döküldükten sonra en az 48 saat boyunca ters çevirmeyin.
10. Resipiyent klonun arka planına bağlı olarak, 10-21 günlük inkübasyonun ardından seçilim plaklarındaki agaroz içerisinde kolonilerin oluşup oluşmadığını kontrol edin. Her iki antibiyotiğin varlığında plakta büyüyen en az 5-10 koloniyi, sterilize edilmiş pamuk tıpalı 5,75 in borosilikat pipet kullanarak seçin ve bunları uygun antibiyotikli 1,5 mL 1x BSK içine inoküle edin.
11. İnoküle edilen kolonileri 3 °C'de 3-5 gün boyunca veya karanlık alan mikroskopisi kullanılarak 20x büyütmede alan başına yaklaşık 20-40 spiroket yoğunluğuna ulaşana kadar büyütün.
    NOTE: Tarama işleminden sonra, spiroketler, eşit hacimdeki kültürün %60 gliserol ve 0,2 µm filtre üzerinden filtrasyonla sterilize edilmiş %40 1x BSK karışımıyla karıştırılmasıyla −80 °C'de uzun süreli saklama için dondurulabilir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
15 mL konik santrifüj tüpleri (polipropilen)	USA Scientific	5618-8271
Mitomisin C	Thermo Fisher Scientific	BP25312	DİKKAT: potansiyel karsinojen; yalnızca kimyasal çeker ocakta kullanın
5.75" Pasteur pipetleri (pamuk tıpalı/borosilikat cam/steril olmayan)	Thermo Fisher Scientific	13-678-8A	Kullanmadan önce otoklavlayın
50 mL konik santrifüj tüpleri (polipropilen)	USA Scientific	150-121
Mutlak etanol
Eritromisin	Research Products International Corp	E5700-25.0
Gentamisin reaktif çözeltisi	Gibco	15750-060
Glikoz (Susuz Dekstroz)	Thermo Fisher Scientific	BP350-500
HEPES	Thermo Fisher Scientific	BP310-50
Kanamisin sülfat	Thermo Fisher Scientific	25389-94-0