Lentiviral Vektörler Kullanılarak Fare İntestinal Organoidlerine Gen Aktarımı

Özet

Kaynak: Van Lidth de Jeude, J. F., et al. Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids. J. Vis. Exp. (2015)

Bu video, kript benzeri bir yapı içeren süspansiyondan fare intestinal organoidlerinin lentiviral transdüksiyonunu açıklamaktadır. Bazal membran matrisinin bir iskele olarak ve büyüme faktörleri ile takviye edilmiş besiyerlerinin kullanılmasıyla, stabil gen entegrasyonunu sağlamak için lentiviral vektörler uygulanır

Protokol

Organoidlerin Lentiviral Transdüksiyonu

0. Gün:

1. Transdüksiyondan iki gün önce, yaklaşık 50 küçük organoid elde etmek amacıyla, 0,95 cm²'lik dolu bir organoid kuyucuğunu yeni bir kuyucuğa bölün. Organoidleri bölün (Şekil 1A, B).
2. Kistik hiperproliferatif kriptler elde etmek için organoid kültür besiyerini 10 µM Chir99021 ve 10 mM nikotinamid ile takviye edin (Şekil 1C).
   NOT: Kistik kriptler, yeni bölünmüş organoidler Chir99021 varlığında büyütüldüğünde en iyi şekilde gelişir.

2. Gün:

3. Matrigel ve medyumu bir p1000 mikropipet ile aşağı yukarı pipetleyerek karışımı parçalayın ve organoidleri hasat edin. Karışımı 15 mL'lik bir tüpe yerleştirin.
4. Uç açıklığı eritilerek daraltılmış bir Pasteur pipeti kullanarak parçalama işlemini sürdürün. Organoidleri peletlemek için 100 x g'de 5 dk santrifüjleyin.
   NOT: Santrifüj boyutuna bağlı olarak farklı bir santrifüj hızı kullanın. Parçalanmış organoidlerin karışımdan ayrıldığı kesin hızı belirlemek gereklidir.
5. Süpernatantı uzaklaştırın ve 500 µL ön ısıtılmış 1x tripsin (0,25% tripsine benzer) ekleyin. Organoidleri tripsin içinde resüspande edin ve 37 °C'lik su banyosunda 3 dk inkübe edin.
6. 3,5 mL hücre hattı kültür medyumu [%10 fetal calf serum (FCS), %1 penisilin/streptomisin ve glutamin ile takviye edilmiş Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)] ekleyerek tripsini inaktive edin. 500 x g'de 5 dk santrifüjleyin.
7. Süpernatantı uzaklaştırarak yaklaşık 20 µL medyum içinde bir pelet bırakın. Bu son küçük miktardaki medyumla birlikte organoidleri 48 kuyucuklu bir plaktaki bir kuyucuğa aktarın.
8. Transdüksiyon medyumunda yüksek titreli lentivirüs ekleyin, resüspande edin ve düşük transdüksiyon etkinliği ile karşılaşıldığında 3.10 adımına geçin.
   NOT: Etkin transdüksiyon için, tipik olarak bir kuyucuktaki organoidlere 250 µL'lik bir yüksek titreli lentivirüs alikotu ekleyin. Bu, tek bir üretimden hasat edilen tüm lentivirüslerin %50'sini temsil eder.
9. Opsiyonel: Transdüksiyon etkinliğini artırmak için, organoidleri içeren 48 kuyucuklu plak 32 °C'de ön ısıtılmış bir santrifüje yerleştirilerek ve 600 x g'de 1 sa boyunca döndürülerek spinokülasyon gerçekleştirin.
10. Transdüksiyonun gerçekleşmesi için organoid-virüs karışımını kültür inkübatörüne yerleştirin ve 37 °C'de 1 sa inkübe edin.
11. Opsiyonel: Transdüksiyon etkinliğini daha da artırmak için organoidleri kültür inkübatöründe 37 °C'de ek 3 sa daha inkübe edin.
12. 1 mL organoid kültür medyumu ekleyin ve organoid-virüs karışımını resüspande edin, bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve organoidleri peletlemek için mikrosantrifüjde 850 x g'de 5 dk santrifüjleyin.
13. Süpernatantı uzaklaştırın ve peleti 20 µL buz soğukluğundaki Matrigel içinde resüspande edin. Materyal ısındığında katılaştığı için, buz soğukluğundaki PBS'yi birkaç kez aşağı yukarı pipetleyerek soğutulmuş pipet uçları kullanın.
14. Damlacığı 48 kuyucuklu bir plaktaki kuyucuğun ortasına yerleştirin ve katılaşması için 37 °C'deki kültür inkübatöründe 15 dk inkübe edin.
15. 15 dk sonra, 10 mM nikotinamid, 10 µM Chir99021 ve 10 µM Y27632 ile takviye edilmiş 250 µL organoid kültür medyumu dikkatlice ekleyin. Küçük parçalanmış organoid fragmanları, 24 saat içinde küçük kistik organoidlere dönüşecektir.

5. Gün:

16. Besiyerini yenileyin ve seçici antibiyotikler ekleyin (puromisin için 4 µg/mL kullanın).

7. Gün:

1. Besiyerini, seleksiyon antibiyotiği eklenmiş standart organoid kültür besiyeri ile değiştirin.
   NOT: Tomurcuklanma, Chir99021 çekildikten 2-3 hafta sonra tamamlanacaktır. Seleksiyondan sonra, organoidler seleksiyon antibiyotikleri olmadan büyütülebilir.

Sonuçlar

Şekil 1: Organoid transduksiyonu için lentivirüs üretiminin şeması.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Polietilen imin	Polysciences	23966-2
DMEM besiyeri	Lonza	BE12-614F
Fetal sığır serumu	Lonza	DE14-801F
Penisilin-streptomisin	Invitrogen	15140-122
Glutamin	Invitrogen	25030-024
Matrigel	BD	BD 356231
Advanced DMEM-F12	Gibco	12634-010
N2	Invitrogen	17502-048
B27	Invitrogen	17504-044
N-asetil sistein	Sigma	A9165-1G
Mouse Egf	Invitrogen	PMG8045
Hepes 1 M	Invitrogen	15630-056
Glutamax 100x	Invitrogen	35050-038
Chir 99021	Axon	1386
Y27632	Sigma	Y0503-5MG
Polybrene	Sigma	107689
Nikotinamid	Sigma	N0636
Tripsin	Lonza	BE02-007E