Çift Adenovirüs Transdüksiyonu Kullanarak SMAD Yolak Aktivasyonunun Tespit Edilmesi

Özet

Kaynak: Chen, H., et al. Live Cell Imaging of the TGF-β/Smad3 Signaling Pathway In Vitro and In Vivo Using an Adenovirus Reporter System. J. Vis. Exp. (2018).

Bu video, çift adenoviral enfeksiyon kullanarak meme kanseri hücrelerinde SMAD yolak aktivasyonunu inceleme yöntemini göstermektedir. Bir virüs sürekli eksprese edilen bir GFP geni iletirken, diğeri SMAD-duyarlı bir promotör altında bir RFP raporlayıcısı taşımaktadır. TGF-beta stimülasyonu üzerine SMAD proteinleri aktive olarak RFP ekspresyonunu indükleyen bir kompleks oluşturur. Canlı hücrelerde çift sinyalin saptanması, yolak aktivasyonunu doğrular.

Protokol

1. Canlı Tek Hücrelerde Çift Adenovirüs Transdüksiyonu

1. 1,0 - 1,5 x 10⁵ MDA-MB-231 hücreleri ile 500 μL 12 kuyucuklu bir plakanın her bir kuyucuğuna, %5 fetal bovine serum (FBS) içeren dulbecco’s modified eagle medium (DMEM) kültür ortamından 50 μL ekleyin (%35 hücre konfluensliği, toplam 2 kuyucuk).
2. Hücreleri şunlarla enfekte edin: 75 μL adenoviral vektör Ad-CMV-GFP'den (titre = 5 x 10⁹ PFU/mL) ve 7.5 μL adenoviral vektör Ad-CAGA12-Td-Tom'un (titre = 5 x 10¹⁰ %10 enfeksiyon pozitifliğine ulaşabilen 2.50 enfeksiyon çokluğu (MOI) elde etmek için (PFU/mL)
3. Hücreleri şu madde ile veya bu madde olmadan tedavi edin: 0.25 μL transforming büyüme faktörü-beta (TGF-β) kuyucuk başına (stokta 10 mg/mL, final konsantrasyonu 5 ng/μL (nihai konsantrasyon olarak) adenovirüs enfeksiyonunun hemen ardından.
4. Plakayı, ... derece sıcaklıktaki inkübatöre yerleştirin 37 °C %10 CO2 ile₂ 24 saat boyunca.
5. Canlı hücreleri faz kontrastlı floresan mikroskop ile görüntüleyin. Yeşil floresan proteini (GFP)'ni 470 nm'de ve Td-Tomato proteinini 54 nm'de uyarın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
DMEM	ThermoFisher	181024	Kullanmadan önce 37 °C su banyosunda ısıtın
Fetal Bovin Serum	Scientifix Life	FBS50-S	Kullanmadan önce ısı ile inaktive edin
Rekombinant İnsan TGF-β1	PEPROTECH	10-21	Final konsantrasyonu 10 mg/mL olacak şekilde DDW ile alikotlayın
Faz kontrast floresan mikroskopisi	OLYMPUS	IX50
MDA-MB-231	ATCC	CRM-HTB-26
Çözelti			Bileşim
FBS-DMEM			%5 ısı ile inaktive edilmiş FBS; 10 μg/mL penisilin; 10 μg/mL streptomisin