Enfekte İnsan Lenfositlerinde Viral Nükleik Asitlerin ve Proteinlerin Çoklu Floresan Görüntülemesi

Özet

Kaynak: Shah, R., et al. Single-Cell Multiplexed Fluorescence Imaging to Visualize Viral Nucleic Acids and Proteins and Monitor HIV, HTLV, HBV, HCV, Zika Virus, and Influenza Infection. J. Vis. Exp. (2020)

Bu video, dallanmış DNA hibridizasyonu ve immünofloresans kullanarak enfekte insan lenfositlerinde HIV-1 DNA, RNA ve kapsid proteininin eş zamanlı görselleştirilmesini göstermekte ve böylece tekil hücreler içindeki viral replikasyon aşamalarının detaylı analizine olanak tanımaktadır.

Protokol

1. Protein immün boyama: İlgilenilen protein(lerin) işaretlenmesi için

1. PBS (fosfat tamponlu salin) çözeltisini boşaltın ve lam üzerine 200 µL bloklama tamponu (%1 w/v BSA (sığır serum albümini), %10 v/v FBS (fetal sığır serumu) içeren PBS ile %0,1 v/v Tween-20 (PBST)) ekleyin. Oda sıcaklığında (RT) 1 saat inkübe edin.
2. Bloklama tamponunu boşaltın ve PBST + %1 w/v BSA içinde seyreltilmiş 200 µL primer antikor uygulayın. Oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.
3. Lamı, oda sıcaklığında çalkalayarak PBST ile iki kez 10 dakika boyunca yıkayın.
4. Seçilen bir sekonder antikoru, PBST + %1 w/v BSA içinde oda sıcaklığında 1 saat boyunca uygulayın.
5. Lamı, oda sıcaklığında çalkalayarak PBST ile 10 dakika boyunca yıkayın.

2. Nükleer boyama: İmmünboyama sonrası çekirdeklerin karşı boyanması

1. PBST'yi boşaltın ve DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) veya seçtiğiniz bir nükleer boyayı oda sıcaklığında (RT) 1 dk boyunca uygulayın.
2. Lamı, oda sıcaklığında (RT) çalkalayarak PBS ile iki kez 10 dk boyunca yıkayın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Anti-HCV NS5a antikoru	Abcam	ab13833	Fare monoklonal; HCV genotipleri 1a, 1b, 3 ve 4 ile çalışır
Anti-HIV-1 p24 monoklonal antikoru	NIH AIDS Reagent Program	3537
Anti-Mov10 antikoru	Abcam	ab80613	Tavşan poliklonal
Sığır serum albümini			İmmunboyama için bloklama reaktifi
Suplementli hücre besiyeri			Hücre modeline uygun besiyeri
Lamel
DAPI	ACD Bio		Çekirdek boyası (ACD Bio'dan RNAscope kiti)
Dulbecco fosfat tamponlu salin (1X PBS)	Gibco	14190250	Kalsiyum ve magnezyum içermez
Fetal sığır serumu (FBS)			Sekonder antikoru üretilen seruma uygun spesifik FBS kullanın (örneğin keçi FBS)
Fisherbrand colorfrost plus mikroskop lamları	Fisher Scientific	12-550-17/18/19	Önceden temizlenmiş
Lamlar
Tween-20			DNA hibridizasyon tamponu ve PBS-T için