Prototip Köpük Virüsü İntazomlarının Boyut Dışlama Kromatografisi ile Saflaştırılması

Özet

Kaynak: Mackler, R. M., et al. Assembly and Purification of Prototype Foamy Virus Intasomes. J. Vis. Exp. (2018)

Bu video, tuz ekstraksiyonu ve boyut dışlama kromatografisi kullanılarak karma bir protein-DNA süspansiyonundan prototip köpüklü virüs (PFV) intasomlarının saflaştırılmasını ve aşağı akış analizleri için aktif komplekslerin elde edilmesini göstermektedir.

Protokol

1. İntasom Solubilizasyonu

1. Temiz bir yüzeyde, yeni bir jilet veya skalpel bıçağı ile 200 µL'lik bir ucun ucundan 2-4 mm keserek iki adet geniş ağızlı pipet ucu hazırlayın.
   NOT: Uçlar 1.3 ve 1.5. adımlarda kullanılacaktır.
2. Diyaliz tüpünü diyaliz tamponundan çıkarın. İntazom örneğinin, klipsin yanındaki tüp ucunda kalabilecek diyaliz tamponu ile seyreltilmesini önlemek için, fazla diyaliz tamponunu uzaklaştırmak amacıyla küçük bir pipet ucu takılı mikropipet kullanın. Diyaliz tüpünün bir ucundaki klipsi çıkarın.
3. Diyaliz tüpünün içindeki çökelek dahil örneği, buz üzerindeki 1,5-mL'lik bir tüpe aktarmak için 1.1. adımdaki geniş ağızlı pipet ucunu kullanın. 
   NOT: Geri kazanılan materyalin toplam hacmi tipik olarak ~140 µL'dir.
4. Çökelek içeren örnek 200 mM NaCl konsantrasyonundadır; uygun hacimde stok 5 M NaCl çözeltisi ekleyerek tuzu 320 mM NaCl final konsantrasyonuna çıkarın. Örneğin, 150 µL'lik bir örnek için, final hacmi 155 µL olacak şekilde 3,9 µL 5 M NaCl ve 1,1 µL ddH₂O ekleyin. İçinde örneğin bulunduğu buz kovasını 4 ˚C'lik soğuk odaya taşıyın.
5. Çökeleği pipetleme yoluyla yeniden süspanse etmek ve çözmek için 1.1. adımdaki geniş ağızlı pipet ucunu kullanın. En az 1 saat boyunca her 20 dakikada bir tekrarlayın. Çökeleğin büyük kısmının çözünmesi gerektiğini gözlemleyin.
   NOT: Çökeleği yeniden süspanse etmek için yapılan pipetleme, çökeleğin zaman noktaları arasında artık belirgin şekilde azalmadığı anlaşıldığında durdurulabilir. ViralDNA (vDNA) işaretlenmediğinde veya içten işaretlendiğinde, görsel incelemeye göre çökelek ~%90 oranında azalır. Cy5 uç işaretli vDNA durumunda çökelek sadece ~%20 oranında azalır; florofor uç işaretli vDNA içeren çökeleğin çoğu çözünmeyecektir. Etkili bir şekilde çözünen çökelek miktarı değişkendir ve ampirik olarak belirlenmelidir.

2. İntazom Purifikasyonu

1. 250 mL boyut dışlama kromatografisi (SEC) yürütme tamponu (20 mM Bis-tris propan, pH 7.5, 320 mM NaCl, %10 gliserol) hazırlayın. Tamponu 0.2-µm'lik bir filtre ünitesiyle steril filtreleyin ve 4 ˚C'de saklayın.
   NOT: Tüm saflaştırma adımları 4 ˚C'lik soğuk odada gerçekleştirilir.
2. Çapraz bağlı agaroz SEC kolonunu (çap = 10 mm; uzunluk = 300 mm; yatak hacmi = 24 mL; numune hacmi = 25 - 500 µL; maksimum basınç = 1.5 MPa; dışlama sınırı = 4 x 10⁷ Da; 5 ile 5,000 kDa arasındaki moleküler ağırlıkları ayırır, Materyal Tablosuna bakınız), 0.4 mL/dak akış hızında SEC yürütme tamponu ile dengeleyin.
   NOT: Bu saflaştırma işlemi, Superose 12 10/300 GL veya Superose 6 Increase gibi 300 kDa'yı 44 kDa'dan etkili bir şekilde ayırabilen farklı boyut dışlama kolonlarına uyarlanabilir. Superose 12 10/300 GL daha düşük çözünürlüğe sahiptir, bu da piklerin daha fazla örtüşmesine neden olur. Aksine, Superose 6 Increase daha yüksek çözünürlüğe sahiptir ve daha iyi ayırım sağlar.
3. Kalan çökeletleri pelletlemek için intasom numunesini bir mikrosantrifüjde, 4 ˚C'de, 14,000 x g hızında 10 dak boyunca santrifüjleyin. Süpernatantı dikkatlice alın. Süpernatantı 200 µL'lik bir enjeksiyon döngüsüne (~200 μL tutabilen tüp) yükleyin. Numuneyi SEC kolonuna uygulayın.
   NOT: Daha küçük yükleme hacimleri, SEC ile daha yüksek çözünürlük sağlar.
4. 25 mL SEC yürütme tamponu ile elüsyon yapın ve 270 µL'lik 95 fraksiyon toplayın. SEC kromatogramının üç A₂₈₀/A₂₆₀ piki gösterdiğini gözlemleyin (Şekil 1).
   NOT: İlk pik bir agregat (~9.0 - 11.5 mL elüsyon), ardından PFV tetramer intasom piki (~12.0 - 14.75 mL elüsyon) ve serbest vDNA ile birlikte PFV IN monomer piki (~15.0 - 18.0 mL) olmalıdır.

Sonuçlar

Şekil 1: Boyut dışlama kromatogramı. Bir PFV intasom kompleksiyse, bir agaroz SEC kolonu ile ayrıştırılmıştır. Bu kolon; agregatın (1), bir PFV IN tetramerinden ve iki vDNA'dan oluşan PFV intasomunun (2) ve monomerik PFV IN ile vDNA'nın (3) ayrıştırılmasına olanak tanır. Bu örnek, 650 nm eksitasyon ile tespit edilen, dahili Cy5 florofor etiketli vDNA içermektedir. y-ekseni, mili-absorbans birimleri (mAU) cinsinden optik yoğunluğu (OD) belirtmektedir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
DNA Oligomerleri	IDT	N/A	Özel DNA Oligoları
NaCl	P212121	RP-S23020
BIS-TRIS propan, >=99.0% (titrasyon)	Sigma-Aldrich	B6755-500G
Gliserol	Thermo Fisher Scientific	G37-20
Jel yükleme uçları, 1 - 200 μL	Corning	CLS4853-400EA
Jilet; Tek taraflı; 100'lü Paket	Fisher Scientific	12-640
Diyaliz tüpü klipsleri	Spectrum Labs	132734
6-8 kDa 10 mm Diyaliz Tüpü	Spectrum Medical	132645
Superose 6 10/300 GL	GE Healthcare Life Sciences	17517201