Real-Time Kantitatif Polimeraz Zincir Reaksiyonu (qPCR) Analizi için Viral RNA Elde Edilmesi

Özet

Kaynak: Suzuki, Y., et al. Measuring Dengue Virus RNA in the Culture Supernatant of Infected Cells by Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction. J. Vis. Exp. (2018).

Bu video, kantitatif PCR (Polimeraz zincir reaksiyonu) analizi için viral örneklerin hazırlanma prosedürünü göstermektedir. Viral örnekler ve RNA standartları seri olarak seyreltilir, proteinaz K tamponu ile işlem görür ve RNA'yı serbest bırakmak için kontrollü sıcaklıklarda inkübe edilir. İşlem görmüş RNA, daha sonra viral RNA seviyelerinin kantifikasyonu için stabilize edilir ve saklanır.

Protokol

1. RT-qPCR (Gerçek zamanlı kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu) için Virüs Örneklerinin İşlenmesi

NOT: 1.1–1.3 adımları biyolojik güvenlik kabini içinde gerçekleştirilmelidir. Özellikle, enfeksiyöz virüs içeren kültür süpernatantının işlemleri, biyogüvenlik seviyesi 2 (veya daha yüksek) bir ortamda yürütülmelidir.

1. 199 μL işlem tamponu ve 1 μL nükleaz içermeyen proteinaz K karıştırın.
2. 40 units/mL RNaz inhibitörü içeren hücre kültürü ortamı (örneğin, %10 fetal sığır serumu ve antibiyotikler ile desteklenmiş DMEM (Dulbecco modifiyeli eagle ortamı) [DMEM/%10 fetal sığır serumu]) kullanarak, sentezlenmiş DENV (dengue virüsü) 3’UTR (çevrilmeyen bölge) RNA'sını (ribonükleik asit), 5 x 10⁹ ile 5 x 10³ kopya/μL RNA standardı elde edecek şekilde 1:10 oranında seri olarak dilüe edin.
3. 8 tüplü PCR (polimeraz zincir reaksiyonu) şeritleri veya 96 kuyucuklu bir PCR plakası kullanarak, DENV enfekte hücrelerin kültür süpernatantından 5 μL ve DENV 3’UTR RNA standardından 5 μL'yi, 5 μL işlem tamponu/proteinaz K çözeltisi ile karıştırın. Kalıp içermeyen kontrol (NTC) olarak, 5 μL hücre kültürü ortamını (yani virüs içermeyen) 5 μL işlem tamponu/proteinaz K çözeltisi ile karıştırın.
4. Kısa bir santrifüj işleminin ardından, örnekleri bir termosiklet cihazında şu koşullarla inkübe edin: 1 döngü (10 dk 25 °C ve 5 dk 75 °C).
NOT: Real-time PCR analizi aynı gün yapılacaksa, işlenmiş örnekler 4 °C'de saklanabilir. Uzun süreli saklama için örnekler -80 °C'de muhafaza edilmelidir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
SimpliAmp Thermal Cycler	Thermo Fisher Scientific	A24811	Benzer bir termal döngüleyici cihaz kullanılabilir, ancak PCR döngü koşullarının optimize edilmesi gerekir.
Recombinant RNase Inhibitor	Takara Bio. Inc	2313A	40 units/μL
RNeasy Mini Kit	Qiagen	74104	Benzer bir RNA saflaştırma kiti kullanılabilir.
Proteinase K	Nacalai Tesque	15679-06	>600 units/mL. Benzer bir reaktif kullanılabilir.
MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate, 0.1 mL	Thermo Fisher Scientific	4346907	Real-time PCR cihazına bağlı olarak benzer bir plaka veya tüp kullanılabilir, ancak PCR döngü koşullarının optimize edilmesi gerekir.