İnsan Karaciğer Kanseri Hücrelerinden Hepatit E Virüsü Partiküllerinin Hasadı

Özet

Kaynak: Meister, T. L., et al. A Cell Culture Model for Producing High Titer Hepatitis E Virus Stocks. J. Vis. Exp. (2020).

Bu video, transfekte edilmiş insan hepatosellüler karsinom hücrelerinden hepatit E virüsü (HEV) partiküllerinin izole edilme sürecini göstermektedir. Hücre dışı viral partiküller filtrelenmiş süpernatanlardan toplanırken, hücre içi partiküller hücrelerin tekrarlanan dondurma-çözme döngülerine tabi tutulmasıyla serbest bırakılır. Lizat santrifüj edilir ve HEV partikülleri içeren süpernatan, gelecekte kullanım için alikotlara ayrılarak ultra düşük sıcaklıkta saklanır

Protokol

1. Hücre kültüründen türetilen HEV (HEVcc) üretimi için HepG2 hücrelerinin hazırlanması
NOT: Kontaminasyonu önlemek için hücrelerin hazırlanması, elektroporasyon, enfeksiyon, hasat ve hücre fiksasyonu işlemleri, biyogüvenlik seviyesi 2 olan bir tesiste steril koşullar altında gerçekleştirilmiştir. Hücreleri içeren 37 °C'deki inkübasyon basamakları, %5 CO₂ inkübatöründe tamamlanmıştır.

1. HEVcc üretimi için HepG2 hücrelerini hazırlamak amacıyla (Şekil 1), hücreleri tam Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (bkz. Tablo 1) içerisinde 15 cm'lik kollajen (bkz. Tablo 1, kollajen eklemeden önce steril filtreli fosfat tamponlu salin (PBS)-asetik asit karışımını 0,2 µm gözenekli filtreden geçirin) kaplı kültür plağına ekin. Hücreler %90 konfluansa ulaşana kadar 37 °C'de inkübe edin.
   NOT: %90 konfluans değerine sahip her bir 15 cm'lik plak, 4 elektroporasyona kadar yetecek miktarda hücre üretecektir.
2. Besiyerini plaktan nazikçe uzaklaştırın ve hücreleri 10 mL 1x PBS ile bir kez yıkayın. Hücrelerin üzerine 3 mL %0,05 trypsin-EDTA ekleyerek tripsinizasyon yapın ve hücreler tamamen ayrılana kadar 37 °C'de inkübe edin. Hücreleri 10 mL tam DMEM besiyerinde resüspande edin ve hücre süspansiyonunu 50 mL'lik bir tüpe aktarın. Toplam hücre sayısını belirleyin.
3. Her bir elektroporasyon 5 x 10⁶ hücre gerektirdiğinden, uygun hacmi yeni bir 50 mL'lik tüpe aktarın ve 1x PBS ile en az 35 mL'ye tamamlayın. Hücreleri 20 x g'de 5 dakika boyunca santrifüjleyin ve hücre peletini bozmadan süpernatanı dikkatlice uzaklaştırın.
4. Hücreleri tekrar 35 mL 1x PBS ile 20 x g'de 5 dakika boyunca yıkayın. Hücreleri süspansiyonda tutmak için 1x PBS'yi henüz uzaklaştırmadan hücreleri buza yerleştirin.

2. HepG2 hücrelerinin elektroporasyonu

1. HepG2 hücrelerinin elektroporasyonu için (Şekil 2hazırlayın 400 µL elektroporasyon yoluyla, ... ekleyerek tamamlanmış Cytomix'in 384 µL Cytomix'in (bkz. Tablo 1) 2 mM ATP ve 5 mM Glutatyon ile. Kullanımdan hemen önce taze olarak hazırlayın ve doğrudan buza yerleştirin.
   NOT: Aşağıdaki adımların doğru ancak hızlı bir şekilde uygulanması kritik önem taşır. Bu nedenle, her şeyin uygun şekilde hazırlandığından emin olun.
2. 4.4. adımındaki hücre peletini dağıtmadan 1x PBS'yi dikkatlice uzaklaştırın. 5 x 10⁶ hücrelerdeki 400 µL tam Cytomix'den ve ekleyin 5 µg RNA. Çözeltiyi 4 mm'lik bir küvete aktarın ve bir kez şu ile pulse yapın: 975 µFbir elektroporasyon sistemi ile 20 ms boyunca 270 V uygulanarak.
   1. Elektroporasyondan sonra hücreleri, her bir elektroporasyon için 1 mL tamamlanmış DMEM içeren tüplere bir Pasteur pipeti ile mümkün olduğunca hızlı bir şekilde aktarın.
      NOT: RNA'nın HepG2 hücrelerine başarılı bir şekilde transfekte edildiğinden emin olmak için bir transfeksiyon kontrolü (TC) gerçekleştirilecektir. Beklenen transfeksiyon oranları, ORF2-pozitif hücrelerin %40-60'ı arasında değişmektedir.
3. Elektropore edilmiş 10 mL hücreyi, kollajen ile kaplanmış 10 cm'lik bir kültür kabına aktarın. 1,3 x 10⁵ elektropore edilmiş hücreler (300 µL) kolajen kaplı, üzerinde lamel bulunan bir 24'lü mikroplaka kuyucuğuna (daha sonra transfeksiyona kontrol olarak kullanılacaktır). Hücreleri eşit şekilde dağıtın ve şu koşullarda inkübe edin: 37 °C.
   1. 24 saat sonra, 10 cm'lik kaptaki besiyerini değiştirin ve yerine 10 mL taze tamamlanmış DMEM ekleyin. Transfeksiyon kontrolünün besiyerini değiştirmeyin. Şurada 6 gün daha inkübe edin: 37 °C.

3. Hücre kültürü kaynaklı intra- ve ekstrasellüler HEV'nin (HEVcc) hasadı

1. Ekstrasellüler HEVcc toplamak için (Şekil 3), 6 gün sonra 10 cm'lik kapta elde edilen süpernatantı, hücre kalıntılarını uzaklaştırmak amacıyla 0.45 µm'lik bir filtreden geçirin. Toplanan ekstrasellüler HEVcc'yi aynı gün yapılacak enfeksiyonlar için 4 °C'de, aksi takdirde -80 °C'de saklayın.
2. İntrasellüler HEVcc toplamak için (Şekil 3), hücreleri 1x PBS ile yıkayın ve 1.5 mL 0.05% tripsin-etilendiamino tetraasetik asit (tripsin-EDTA) ekleyerek tripsinizasyon yapın. Hücreler tamamen ayrılana kadar 37 °C'de inkübe edin. 10 mL complete DMEM ekleyin, hücreleri ayırmak için plakla yıkayın ve hücre süspansiyonunu 50 mL'lik bir tüpe aktarın. Hücreleri iki kez PBS ile yıkayın. 20 x g'de 5 dk santrifüjleyin.
   1. Süpernatantı dökün ve hücre peletini, elektroporasyon başına 1.6 mL complete DMEM içinde yeniden süspanse edin. Hücre süspansiyonunu 2 mL'lik bir reaksiyon tüpüne aktarın.
      NOT: Viral yükleri önemli ölçüde azaltacağı için daha büyük hacimler kullanmayın.
   2. Hücreleri dondurun (sıvı azot içinde) ve çözün. Bu işlemi 3 kez tekrarlayın.
      NOTE: Lizis verimliliği bozulacağı için, 3 dondurma-çözme döngüsü için birden fazla elektroporasyonu (1.6 mL) birleştirmeyin. Döngüler arasında hücre süspansiyonunu vortekslemeyin. Viral yükleri maksimize etmek için hücre süspansiyonunun yavaşça (örneğin, oda sıcaklığında veya buz üzerinde) çözüldüğünden emin olun.
   3. Hücre kalıntılarını ayırmak için lize edilmiş hücreleri 10.0 x g'de 10 dk yüksek hızda santrifüjleyin. Süpernatantı yeni bir tüpe aktarın. Süpernatantı enfeksiyon için kullanın; aksi takdirde -80 °C'de saklayın.
   4. İsteğe bağlı olarak, viral yükleri artırmak için bir konsantratör kullanarak ekstrasellüler ve intrasellüler HEVcc'yi konsantre edin.

Tablo 1: Tampon Bileşimi Tablosu.

Çalışma çözeltisi	Konsantrasyon	Hacim
Kolajen	40 mL	PBS
	40 µl	Asetik asit
	1 mL	%0,4 steril Kolajen R çözeltisi
Cytomix	120 mM	KCl
	0,15 mM	CaCl22
	10 mM	K2HPO4 (pH 7,4)
	25 mM	HEPES
	2 mM	EGTA
Tam DMEM	50 mL	DMEM
	5 mL	Pen/Strep
	5 mL	MEM NEAA (10X)
	5 mL	L-Glutamin
	50 mL	Fetal bovine serum
Tam DMEM	50 mL	MEM
	5 mL	Sodyum piruvat
	5 mL	Gentamisin
	5 mL	MEM NEAA (10X)
	5 mL	L-Glutamin
	50 mL	ultra düşük IgG

Sonuçlar

Şekil 1: Hücre kültürü kaynaklı HEV (HEVcc) üretimi için HepG2 hücrelerinin hazırlanmasına yönelik şematik deneysel düzenek.

Şekil 2: HepG2 hücrelerinin elektroporasyonu için şematik deney düzeneği.

Şekil 3: Hücre içi ve hücre dışı HEVcc hasadı için şematik deneysel kurulum.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
0.45 µm mesh	Sarstedt	83.1826	Ekstrasellüler virüs hasadı
MEM	gibco	31095-029	Hücre kültürü
MEM NEAA (10×)	gibco	1140-035	Hücre kültürü
Trypsin-EDTA (0.5 %)	gibco	154054	Hücre kültürü
ultra-low IgG	gibco	192105PJ	Hücre kültürü
Acetic acid	CarlRoth	675.1	Kolajen çalışma çözeltisi
ATP	Roche	14096501	In vitro transkripsiyon ve elektroporasyon
BioRender	BioRender		Şekil oluşturma
Calcium chloride	Roth	5239.2	Sitomiks
Collagen R solution 0.4 % sterile	Serva	47256.01	Kolajen çalışma çözeltisi
DMEM	gibco	41965-039	Hücre kültürü
EGTA	Roth	3054.3	Sitomiks
GenePulser Xcell Electroporation System	BioRad	1652660	Elektroporasyon
HEPES	Invitrogen	15630-03	Sitomiks
Di-potassium hydrogen phosphate	Roth	P749.1	Sitomiks
KCL	Roth	6781.3	Sitomiks
Potassium di-hydrogen phosphate	Roth	3904.2	Sitomiks
L-Glutamin	gibco	2503081	Hücre kültürü
L-Glutathione reduced	Sigma-Aldrich	G4251-5G	Sitomiks
MEM	gibco	31095-029	Hücre kültürü
MEM NEAA (10×)	gibco	140-035	Hücre kültürü
Magnesium chloride	Roth	2189.2	Sitomiks
Microvolume UV-Vis spectrophotometer NanoDrop One	Thermo Fisher	ND-ONE-W	DNA/RNA konsantrasyonu
PBS	gibco	701051	Hücre kültürü
Pen/Strep	Thermo Fisher	1514012	Hücre kültürü