Embriyonasyonlu Tavuk Yumurtalarının Allantoik Sıvısından Virüs Purifikasyonu

Özet

Kaynak: Yates, J. G. E., et al. Production of High-Titer Recombinant Newcastle Disease Virus from Allantoic Fluid. J. Vis. Exp. (202)

Video, virüsle enfekte edilmiş embriyolu tavuk yumurtalarından toplanan berraklaştırılmış allantoik sıvıdan virüs partiküllerinin saflaştırılmasını ve konsantre edilmesini göstermektedir. Videoda, bütün virüsleri izole etmek için derinlemesine filtrasyon, teğetsel akış filtrasyonu ve yoğunluk gradyanlı ultrasantrifüjasyonu içeren bir dizi filtrasyon ve ayırma adımı sunulmaktadır. Virüs açısından zengin fraksiyon, ardından kalıntı tuzları ve gradyan bileşenlerini difüzyon yoluyla uzaklaştırmak için diyalize edilmekte ve ardından osmoz yoluyla hipertonik bir çözelti kullanılarak konsantre edilmektedir. Sonuç, deneysel kullanım için uygun, saflaştırılmış ve yüksek titreli bir virüs preparasyonudur.

Protokol

1. Belirlenmiş patojen içermeyen embriyonik tavuk yumurtaları kullanılarak Newcastle hastalığı virüsünün (NDV) amplifikasyonu

1. Spesifik patojen içermeyen (SPF) embriyolu tavuk yumurtalarının inokülasyonu
   NOT: Genellikle, bir in vivo kalite Newcastle hastalığı virüsü (NDV) partisi üretmek için sekiz düzine SPF embriyolu tavuk yumurtası kullanılır. Nakliye sırasında oluşabilecek hasarları ve canlılık değişkenliğini hesaba katarak bir veya iki düzine fazladan yumurta sipariş edin.
   1. SPF embriyolu tavuk yumurtalarını teslim aldıktan sonra, 37 °C sıcaklık ve %60 nemdeki bir yumurta inkübatöründe 9 gün boyunca inkübe edin. İnkübatörün yumurtaları her saat başı otomatik olarak sallayacak/döndürecek şekilde ayarlandığından emin olun.
      NOT: Yumurtalar oda sıcaklığında 24 saate kadar veya 4 °C'de 72 saate kadar saklanabilir; ancak bu durum embriyo canlılığını azaltabilir.
   2. 8-1 günlük inkübasyonun ardından (ideali 9. günde), embriyo canlılığını belirlemek için yumurtaları ışıkla muayene edin (candling). Canlı embriyoların göstergesi olarak ağsı damar yapısını (Şekil 1A) ve embriyo hareketini gözlemleyin. Bu özelliklere sahip olmayan yumurtaları imha edin (Şekil 1B).
   3. Canlı yumurtalarda, hava kesesi ile embriyo arasındaki ara yüzeyi kurşun kalemle bir 'X' ile işaretleyin (Şekil 1A). Bu enjeksiyon bölgesinin damar yapısının delinmesine neden olmayacağından emin olun. İnokülüm hazırlanırken işaretli yumurtaları inkübatöre geri yerleştirin.
   4. Tüm SPF embriyolu tavuk yumurtalarına enjekte edilmesi gereken virüs miktarını hesaplayın. Her yumurtanın 10 µL hacimde 10 plak oluşturan birim (PFU) virüs aldığından emin olun; virüsü fosfat tamponlu salin (PBS) içinde 1 × 10³ PFU/mL konsantrasyona seyreltin. Virüs uygulamasındaki hataları telafi etmek için %20 oranında fazla inokülüm hazırlayın.
   5. Antistatik bir mendil kullanarak, işaretli yumurtaların üst kısımlarını %70 etanol içinde seyreltilmiş %10'luk iyot çözeltisi ile temizleyin. Çözeltinin kuruması için yaklaşık 1-2 dakika bekleyin.
   6. Steril ve keskin bir cımbız kullanarak kabuğu dikkatlice delin. Yumurtalar arasında cımbızı %70 etanol ile sterilize edin.
   7. 1 mL'lik bir şırınga ve 25 G iğne kullanarak, adım 1.1.4'te hazırlanan inokülümden 10 µL'yi koryoallantoik boşluğa enjekte edin (Şekil 1C). İğne ile yumurtaya yaklaşık 90° açıyla yaklaşın. İğneyi sadece koryoallantoik membranın üst kısmına yerleştirin.
   8. İnokülasyonun ardından, delme bölgesini oje ile kapatın ve yumurtaları inkübatöre geri yerleştirin. İnokülasyondan sonraki 24 saate kadar sallama ayarının AÇIK olduğundan emin olun.
   9. İnokülasyondan 24 saat sonra yumurta canlılığını kontrol edin. Koryoallantoik membranda damar yapısı ve embriyo hareketi bulunmayan ölü yumurtaları atın (Şekil 1B).
      NOT: Bu yumurtalar NDV nedeniyle değil, inokülasyon işlemi nedeniyle ölmüştür.
   10. Allantoik sıvının yumurta proteinleri ile kontamine olmasını önlemek için sallama ayarı KAPALI konumdayken yumurtaları inkübatöre geri yerleştirin.
   11. Ölü yumurtaları tespit etmek için adım 1.1.9'da açıklandığı gibi her 12-24 saatte bir yumurtaları kontrol edin. İnokülasyondan 24 saat sonra ölen yumurtaları, otolizi minimize etmek için 4 °C'ye taşıyın. Allantoik sıvıyı soğutmadan sonraki 2-12 saat içinde hasat edin.
   12. Yumurtaları en az 72 saat inkübe edin.
       NOT: NDV'nin mezojenik bir suşu propagate ediliyorsa, optimal inkübasyon süresi 60-72 saattir; çünkü uzun inkübasyon süreleri, allantoik sıvının berraklığının azalması nedeniyle saflaştırma işlemini bozabilir. Lentojenik NDV suşları propagate edilirken bu sorun o kadar kritik değildir, çünkü embriyoyu öldürmeleri çok daha uzun sürer.
   13. Uygun inkübasyon süresinden sonra, allantoik sıvıyı hasat etmeden önce kalan yumurtaları 2-12 saat boyunca 4 °C'ye taşıyın.
2. NDV içeren allantoik sıvının hasadı
   1. Soğutulmuş yumurtaları biyogüvenlik kabinine taşıyın. Yumurtaların üst kısımlarını %70 etanol ile temizleyin.
   2. Hava kesesinin bulunduğu yumurtanın apikal tarafını açmak için steril cımbız ve cerrahi makas kullanın.
   3. Koryoallantoik membranı ortaya çıkarmak için kabuğu kaldırın (Şekil 1D).
   4. Membranı dikkatlice delin ve allantoik boşluğu açığa çıkarmak için geri soyun (Şekil 1E). Yumurtayı bozacağı için vitellus kesesinin yanlışlıkla delinmediğinden emin olun.
   5. Küt uçlu pens kullanarak embriyoyu tutun ve embriyonik keseyi açın.
      NOT: Embriyonik kese içindeki sıvı da NDV içerir.
   6. Pens ile embriyoyu bastırın ve 10 mL'lik bir serolojik pipet kullanarak allantoik sıvıyı toplayın.
   7. Allantoik sıvıyı berraklaştırma işlemine kadar 15 mL'lik konik tüplerde buz üzerinde saklayın.
      NOT: Allantoik sıvı sarı renkliyse, vitellus kesesi zarar görmüştür ve allantoik sıvı atılmalıdır.
   8. Allantoik sıvı içeren konik tüpleri 4 °C'de 10 dakika boyunca 1,50 × g'de santrifüj edin.
   9. Duraklama noktası: Berraklaştırılmış allantoik sıvıyı 50 mL'lik konik tüplere paylaştırın ve uzun süreli saklama (örneğin, haftalarca veya aylarca) için -80 °C'de saklayın; virüsü dondurma-çözme döngülerinin sert etkilerinden korumak için sıvıyı %5 son konsantrasyonda sükroz ile destekleyin. Alternatif olarak, kısa süreli saklama (örneğin, 1-3 gün) için, allantoik sıvıyı 4 °C'de saklamadan önce sükroz (final %5) veya 3× Mannitol-Lizin (ML) tamponu (%15 Mannitol, %3 Lizin) ile destekleyerek 1× (%5 Mannitol, %1 Lizin) son konsantrasyona getirin.

2. Allantoik sıvıdan NDV saflaştırılması

1. Alantoik sıvının derinlemesine filtrasyonu
   1. Berraklaştırılmış alantoik sıvıyı -80 °C'de saklayın ve saflaştırmadan önceki gece 4 °C'de çözdürün.
   2. Bir biyolojik güvenlik kabininde, boruları ve peristaltik pompayı Şekil 2'de gösterildiği gibi kurun.
   3. Henüz yapılmadıysa, alantoik sıvıyı 3× ML tamponu ile 1× nihai konsantrasyona gelecek şekilde karıştırın.
   4. Derinlik filtresini takmadan önce, 50 mL 0,5 M sodyum hidroksidi (NaOH) sistemden geçirip bir atık kabına aktararak boruları sterilize edin.
   5. Sistemden 10 mL steril, moleküler düzeyde saf su geçirip atık kabına aktararak boruları durulayın.
      NOT: NaOH, NDV'yi inaktive edeceği için, virüs içeren alantoik sıvı sisteme verilmeden önce hatların yeterince yıkanması önemlidir.
   6. Sistemden 50 mL PBS geçirerek sistemi hazırlayın; tüpte yaklaşık 5 mL PBS kaldığında pompayı durdurun.
   7. Borulara 1-3 µM tutma kapasiteli bir derinlik filtresi takın ve filtreyi havalandırmak için derinlik filtresinin apikal tarafındaki ikinci kapağı çıkarın. Sistemden ek 50 mL PBS geçirmeye başlayın.
   8. PBS filtrenin üstündeki havalandırma deliğinden akmaya başladığında, portu kapatın ve hatlardan PBS akıtmaya devam edin.
      NOT: Küçük hava kabarcıkları kabul edilebilir, ancak büyük miktarda hava olması durumunda filtrenin adım 2.1.7 ve 2.1.8'de açıklandığı gibi tekrar havalandırılması gerekecektir.
   9. Tüpte yaklaşık 5 mL PBS kaldığında pompayı durdurun.
   10. Atık kabını yeni bir steril toplama kabıyla değiştirin ve derinlik filtresinden alantoik sıvıyı geçirmeye başlayın.
       NOT: Basınç 10 psi'yi geçmemelidir, aksi takdirde virüsün parçalanmasına (shearing) neden olur. Basınç, pompanın akış hızı azaltılarak veya artırılarak ayarlanabilir. Basınç 10 psi'yi aşmaya başlar ve akış hızı daha fazla düşürülemezse, yeni bir derinlik filtresi kullanılmalıdır. Bu durumda, alantoik sıvı akışı yeniden başlatılmadan önce adım 2.1.6-2.1.8 tekrarlanmalıdır.
   11. Tüm alantoik sıvı filtreden geçtikten sonra, virüs geri kazanımını maksimize etmek için hatlardan 50 mL 1× ML tamponu geçirin.
   12. Sıvıyı hatlar kuruyana kadar toplayın. Virüsü gece boyunca veya 36 saate kadar 4 °C'de saklayın.
       NOT: Virüs derinlemesine filtrelendikten sonra, saflaştırma işlemine derinlemesine filtrasyonun tamamlanmasından sonraki 36 saat içinde devam edin.
   13. Derinlik filtresini ayırın ve boruları, 0,5 M NaOH içinde saklamadan önce sistemden 10 mL 0,5 M NaOH ve 42 °C'ye ön ısıtılmış 400 ppm çamaşır suyu geçirerek sanitize edin.
2. NDV konsantrasyonu için teğetsel akış filtrasyonu
   1. Kaset bileşenlerini, bir biyolojik güvenlik kabininde Şekil 3A'da gösterildiği gibi birleştirin.
      NOT: Manifold ve uç plaka kullanımdan önce deterjanla yıkanmalı ve kurutulmalıdır. Silikon contalar yeniden kullanılabilir ve kasetle birlikte 0,5 M NaOH içinde saklanmalıdır.
   2. Teğetsel akış filtrasyonu (TFF) (çapraz akış filtrasyonu olarak da bilinir) sistemini 'açık' konfigürasyonda kurun (Şekil 3B).
      1. Kaseti ilk kez kullanıyorsanız, TFF kasetini Elüsyon konfigürasyonunda birleştirin ve 10 mL steril, moleküler düzeyde saf su ile yıkayın (Şekil 3C).
      2. Rezervuar tankında sadece 5 mL su kaldığında, pompayı durdurun ve TFF sistem kurulumunu kapalı konfigürasyona getirin (Şekil 3D).
      3. Rezervuara 42 °C'ye ön ısıtılmış 100 mL 0,5 M NaOH ve 40 ppm çamaşır suyu ekleyin ve 30-60 dakika boyunca sistemde döndürün.
      4. Akışı durdurun ve TFF sistemini elüsyon kurulumuna geri getirerek temizleme çözeltisini elüe etmek için akışı yeniden başlatın.
      5. Rezervuarda yaklaşık 5 mL kaldığında, pompayı durdurun ve sistemi durulamak için 10 mL steril, moleküler düzeyde saf su ekleyin.
      6. Rezervuarda yaklaşık 5 mL kaldığında, pompayı durdurun ve TFF sistemini açık konfigürasyona getirin (Şekil 3B). Adım 2.2.3 ile devam edin.
   3. Peristaltik pompayı kullanarak sistemden 10 mL 0,5 M NaOH geçirerek kaseti ve boruları sterilize edin. Kaset bütünlüğünü korumak için basıncın 30 psi'yi geçmediğinden emin olun.
   4. Rezervuarda yaklaşık 5 mL 0,5 M NaOH kaldığında pompayı durdurun.
   5. Rezervuara 10 mL steril, moleküler düzeyde saf su ekleyin ve sıvının kasetten geçirilmesine devam edin. Virüsün inaktive olmasını önlemek için rezervuarın kenarlarındaki tüm NaOH'ı temizlemek üzere rezervuarı çalkalayın. Rezervuar yıkama adımını tekrarlayın.
   6. Rezervuarda yaklaşık 5 mL steril, moleküler düzeyde saf su kaldığında pompayı durdurun.
   7. Rezervuara 10 mL PBS ekleyin, steril, moleküler düzeyde saf suyun kenarlardan yıkandığından emin olmak için çalkalayın. Kasetten sıvı akışını yeniden başlatın.
   8. Rezervuarda yaklaşık 5 mL kaldığında pompayı durdurun, derinlemesine filtrelenmiş alantoik sıvıyı rezervuara ekleyin ve pompa akışını yeniden başlatın.
   9. Virüsün parçalanmasını önlemek için basınç göstergesi 1'i (Şekil 3B) izleyerek 10 psi'yi geçmediğinden emin olun. Atığa elüsyonu artırmak için peristaltik pompanın hızıyla C-kıskaçlarının kullanımını kombine edin.
      NOT: Peristaltik pompanın hızı ve C-kıskaçlarının birlikte kullanımı basıncın artmasına neden olacaktır.
   10. Rezervuarda 50-10 mL alantoik sıvı kaldığında, 150-20 mL 1× ML tamponu ekleyerek tampon değişimi yapmak için pompayı durdurun.
   11. Pompa akışını yeniden başlatın ve basınç göstergesi 1'in (Şekil 3B) 10 psi'yi geçmediğini tekrar kontrol edin.
   12. Rezervuarda 5-10 mL kaldığında pompayı durdurun.
   13. İki adet C-kıskaç kullanarak, Şekil 3C'de gösterildiği gibi iki atık hattını kapatın.
   14. Rezervuarı besleyen retentat hattını ayırın ve 50 mL'lik konik bir tüpe yerleştirin (Şekil 3C).
   15. Pompa akışını yeniden başlatın ve rezervuar tankında birkaç damla sıvı kaldığında durdurun.
   16. Atık hatlarındaki C-kıskaçlarını çıkarın ve retentat besleme hattını tekrar rezervuar tankına bağlayın (Şekil 3B).
   17. 20-25 mL 1× ML tamponu ekleyin ve rezervuar tankında yaklaşık 5 mL kalana kadar pompa akışını sürdürün.
   18. Adım 2.2.13 ile 2.2.16 arasını tekrarlayın.
       NOT: Virüs verimini artırmak için adım 2.2.17 ve ardından 2.2.13-2.2.16 adımları tekrarlanarak 3. bir elüsyon yapılabilir. Ancak, virüsün çoğu ilk iki elüsyonda bulunur.
   19. Elüsyonlar bittikten sonra virüsü buz üzerinde veya 4 °C'de saklayın.
   20. Hatları temizlemek için, Şekil 3D'de gösterildiği gibi atık hatlarının rezervuara geri beslendiği kapalı döngü formatında (Şekil 3D) sistemi kurun.
   21. 42 °C'ye ön ısıtılmış 250 mL 0,5 M NaOH ve 40 ppm çamaşır suyu ekleyerek sistemi temizleyin.
   22. Temizleme çözeltisini gece boyunca sistemden akıtın.
       NOT: Temizleme çözeltisi resirküle edilirken, pompa 50 mL/dk hızda çalıştırılırsa yaklaşık 5 psi basınç gözlemlenmelidir. Basınç bunu aşarsa kaset kirlidir; temizleme çözeltisi değiştirilmeli ve işlem tekrarlanmalıdır.
   23. Her iki atık hattını ve retentat hattını bir atık kabına yönlendirerek temizleme çözeltisini elüe edin.
   24. Rezervuara 40-500 mL steril su ekleyin ve sistemden geçirerek atık kaplarına akıtın.
   25. Rezervuarda yaklaşık 5 mL kaldığında pompayı durdurun ve rezervuar tankına 10-20 mL 0,5 M NaOH ekleyip rezervuar kabını yıkamak için çözeltiyi çalkalayın.
   26. Rezervuar neredeyse boşaldığında, adım 2.2.23'ü iki kez daha tekrarlayın.
   27. TFF kurulumunu sökün; TFF kasetini ve contaları küçük bir hacim 0,5 M NaOH içinde, yeniden kapatılabilir plastik bir torbada 4 °C'de saklayın.
       NOT: Borular oda sıcaklığında 0,5 M NaOH içinde daldırılmış halde saklanabilir.
3. Iodixanol yoğunluk gradyanı ultrasantrifüjasyonu
   1. Ultrasantrifüjü açın ve 4 °C'ye ön soğutma yapacak şekilde ayarlayın. İstenen rotoru da 4 °C'de ön soğutun (Malzeme Tablosuna bakın).
      NOT: Rotorlar 4 °C'de saklanmalıdır.
   2. PBS ve 3× ML Tamponu ile seyrelterek (ML tamponu nihai 1× konsantrasyonda olacak şekilde), stok %60'lık iodixanol çözeltisini (satın alma anındaki konsantrasyon) kullanarak %40, %20 ve %10'luk iodixanol çözeltileri hazırlayın.
   3. 13,2 mL'lik, üstü açık, ince duvarlı bir ultrasantrifüj tüpüne, sırasıyla %40, %20 ve %10'luk iodixanol çözeltilerinden 0,5 mL, 2,5 mL ve 2,5 mL ekleyerek üst üste katmanlandırın (Şekil 4A).
      NOT: Ultrasantrifüj tüpünü yan yatırmak ve çözeltiyi yavaşça boşaltmak, iki gradyan katmanının karışma riskini önemli ölçüde azaltacaktır. Her katmanın ayrımı belirgin olmalı ve gradyanın her katmanı arasında bir "hale" görülmelidir.
   4. Çeşitli gradyan katmanlarının ara yüzlerini işaretlemek için bir markör kalem kullanın.
   5. TFF prosedüründen elüe edilen virüsün 6-6,5 mL'sini yoğunluk gradyanının üzerine katmanlandırın. Yoğunluk gradyanını bozmamak için virüsü adım 2.3.3'te açıklandığı gibi dikkatlice ekleyin.
   6. Ultrasantrifüj tüplerini, insertleri birbirine 0,01 g hassasiyetle dengelemek için üstü açık bir terazi kullanarak, açılı rotor (swinging bucket rotor) insertlerine yerleştirin (bkz. Malzeme Tablosu). Ağırlık farklarını gidermek için PBS veya ekstra virüs elüenti kullanın.
   7. Tüpler dengelendikten sonra kapaklarını kapatın ve rotora yerleştirin.
   8. 4 °C'de, 125.0 × g'de 1,5 saat santrifüjleyin.
      NOT: Gecikmeli başlatma özelliği olan bir ultrasantrifüj mevcutsa, bu işlem gece boyunca yapılabilir.
   9. Ultrasantrifüjasyonun ardından tüpleri steril bir pens yardımıyla çıkarın. %10 ve %20 gradyanlar arasındaki hedef bandı (büyük bandı) arayın (Şekil 4B).
   10. Tüpü bir destek ayağı kullanarak bir beherle üzerine asın.
   11. 5 mL'lik bir şırıngaya 18 G × 1,5 inçlik bir iğne takın ve ultrasantrifüj tüpünün yan kısmını delin.
       NOT: Tüp, hedef bandın hemen altından, iğne yukarıya doğru açılı ve eğimi (bevel) yukarı bakacak şekilde delinmelidir, böylece iğne hedef bandın içine doğru ilerler.
   12. Hedef bandı çıkarmak için pistonu yavaşça çekin.
       NOT: Ekstraksiyonu maksimize etmek için iğneyi hedef bandın içinde hareket ettirin. Diğer bantların veya kalıntıların hedef bantla karışmamasına dikkat edin ve aşırı çözelti almaktan kaçının, çünkü bu daha fazla diyaliz kaseti kullanılmasına yol açacaktır.
   13. Hedef bant çıkarıldıktan sonra iğneyi çıkarın ve kalan çözeltinin atık beherine akmasına izin verin. Tüm diğer ultrasantrifüj tüplerindeki tüm bantlar çıkarılana kadar hedef bandı 50 mL'lik konik bir tüpe aktarın.
   14. Tüm hedef bantlar tüm ultrasantrifüj tüplerinden çıkarılana kadar adım 2.3.10-2.3.13'ü tekrarlayın.
   15. Adım 2.3.10 ile 2.3.13 arasında açıklanan hedef bantları çıkarma işleminin alternatif yöntemi
       1. Hedef bandın üzerindeki sıvıyı bir pipet kullanarak yavaşça çıkarın. Hedef banda ulaştığınızda, bir pipetle ekstre edin ve virüsü 50 mL'lik konik bir tüpte saklayın.
          NOT: Bu yöntem, ultrasantrifüj tüplerinin yeniden kullanılmasını sağlar.
4. Virüs çözeltisinden iodixanolün uzaklaştırılması
   NOT: NDV içeren bant, %15 ile %16 arasındaki bir iodixanol yoğunluğunda görünür. Çözeltideki iodixanol konsantrasyonu, bir standart eğriye göre 340 nm'deki absorbsiyon ölçülerek belirlenebilir. Bu konsantrasyondaki iodixanol çözeltileri C57BL/6 farelere uygulandığında herhangi bir olumsuz etki veya akut toksisite gözlemlenmediğinden, bu adım atlanabilir.
   1. 0,5-3 mL 10 kDa moleküler ağırlık kesim limitli bir diyaliz kasetini 1 dakika boyunca PBS'ye daldırarak önceden ıslatın.
      NOT: Diyaliz membranı pürüzsüz görünümden buruşuk veya pütürlü bir görünüme geçmelidir. Ekstre edilen virüs hacmi 10 mL'yi aşarsa, iki adet 0,5-3 mL diyaliz kaseti veya bir adet 5-12 mL diyaliz kaseti kullanılmalıdır.
   2. Uygun olduğu şekilde, virüsü 50 mL'lik konik tüpten toplamak için 5 veya 10 mL'lik bir şırınga ve 18 G × 1,5 inçlik küt uçlu (blunt-fill) bir iğne kullanın.
   3. Şırıngayı, membrana zarar vermemeye dikkat ederek diyaliz kasetine yerleştirin ve virüsü enjekte edin.
      NOT: Diyaliz kaseti, kaset içindeki hava boşluğunun konumunu ayarlamak için döndürülebilir. İğne kasetten çıkarılmadan önce hava boşluğu giderilmelidir.
   4. 1 L'lik bir beheri steril 1× PBS ile doldurun, içine bir karıştırma çubuğu ve diyaliz kasetini yerleştirip ağzını kapatın. Hafif karıştırma ile 4 °C'de inkübe edin.
      NOT: Diyaliz kasetinin PBS içinde yüzmesi için ekstrüde polistiren köpük ve bir lastik bant kullanarak sabitleyin. Kaset, ML tamponu nedeniyle hafifçe şişebilir.
   5. 1-2 saat sonra taze 1× PBS ile değiştirin ve hafif karıştırma ile 8-10 saat daha 4 °C'de inkübe etmeye devam edin.
      NOT: Bu işlem gece boyunca da yapılabilir.
   6. Sıvıyı bir kez daha taze 1× PBS ile değiştirin ve oda sıcaklığında 1-2 saat inkübe edin.
5. Virüs çözeltisinin konsantrasyonu
   1. Diyaliz kasetini diyaliz tamponundan çıkarın (Şekil 4C) ve küçük, kapatılabilir plastik bir torbaya yerleştirin. Diyaliz kaseti tamamen suya gömülecek şekilde 15-25 mL %40'lık 20.00 MW polietilen glikol ekleyin.
   2. Sallayarak (rocking) oda sıcaklığında inkübe edin. Kaset içindeki virüs hacmini periyodik olarak 5 veya 10 mL'lik bir şırınga ve 18 G × 1,5 inçlik küt uçlu bir iğne ile kontrol edin.
      NOT: Virüsü konsantre etmek için gereken süre, başlangıç hacmine ve istenen son hacme göre değişecektir. Genellikle, başlangıçtaki alantoik sıvı hacmi ne olursa olsun, istenen nihai hacim 1 ile 1,5 mL arasındadır. Hacmi kontrol ederken aynı portu kullanmamaya dikkat edin; bu, port bütünlüğünü bozar ve polietilen glikol çözeltisinin virüsle karışmasına neden olabilir.
   3. Konsantre virüsü diyaliz kasetinden çıkarmadan önce, kaseti kısaca 1× PBS ile durulayın ve 18 G × 1,5 inçlik küt uçlu bir iğneyi hava ile doldurun.
   4. Hava dolu şırıngayı diyaliz kasetine yerleştirin ve pistonu itin. Konsantre virüsün, içeri verilen hava olmadan çıkarılabilmesi için aparatı döndürün.
   5. Konsantre virüsü 50 mL'lik konik bir tüpe aktarın ve aktarılan hacmi kaydedin.
   6. Aynı şırınga ve iğneyi kullanarak, daha önce çıkarılan virüsle birleştiğinde nihai konsantrasyonu %5 sakroz olacak şekilde, diyaliz kasetine uygun miktarda %60'lık sakroz enjekte edin.
   7. Membrana yapışmış olabilecek kalıntı virüsleri yerinden oynatmak için eldivenli parmaklarınızla membranı nazikçe masaj yaparak ovun, membra zarar vermemeye dikkat edin. Yerinden oynatma işlemini kolaylaştırmak için diyaliz kasetindeki fazla havanın bir kısmını çıkarın.
   8. Bu yıkama çözeltisini 50 mL'lik konik tüpte halihazırda bulunan virüsle birleştirin.
      NOT: Virüs artık %5 sakroz içindedir ve 20 µL, 50 µL, 10 µL veya 20 µL'lik alikotlara ayrılarak -80 °C'de saklanmaya hazırdır. Alternatif olarak, uzun süreli saklama için NDV, bölüm 2.6'da açıklandığı gibi liyofilize edilebilir ve 4 °C'de saklanabilir.

Sonuçlar

Şekil 1: Belirlenmiş patojen içermeyen embriyonik tavuk yumurtalarının NDV ile enfeksiyonu ve hasadı. (A) Embriyo hareketine ek olarak, 9 günlük inkübasyon sonrası ağ benzeri damarlanma (oklar) belirgin olmalıdır. 'X', koriy...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
1 mL Slip-Tip Şırınga	BD	309659
10 mL Luer-Lok Şırınga	BD	302995
%10'luk Povidon İyot Çözeltisi	LORIS	109-08
15 mL Konik Tüpler	Thermo-Fisher	14955240
18G x 1 1/2 in Kör Uçlu Dolum İğnesi	BD	305180
18G x 1 1/2 in Precision Glide İğne	BD	305196
25 G x 5/8 in İğne	BD	305122
5 mL Luer-Lok Şırınga	BD	309646
Glasyal Asetik Asit	Thermo-Fisher	A38-212
Agaroz	Froggabio	A87-50G
Alexa-Fluor 48 Keçi Anti-Fare	Invitrogen	A1001
Allegra X-14 Santrifüj	Beckman Coulter	B0861
Amonyum Persülfat	BioRad	161-0700
Çamaşır suyu (%5)	Thermo-Fisher	36-102-0599
Geniş, tırtıksız uçlu forseps	Thermo-Fisher	09-753-50
Bromofenol Mavisi	Sigma-Aldrich	1405-25G
Centramate Kaset Tutucu	PALL	CM018V
ChemiDoc XRS+	BioRad	1708265
Dijital 1502 Sportsman Yumurta İnkübatörü	Berry Hill	1502W
D-Mannitol	Sigma-Aldrich	M4125-500G
Yumurta Işığı	Berry Hill	A46
Etanol (%70)	Thermo-Fisher	BP82031GAL
Dişi Dişli T Bağlantı Parçaları, naylon, 1/8 inç NPT(F)	Cole-Parmer	06349-50
Nem Kiti	Berry Hill	3030
Iodixanol	Sigma-Aldrich	D156	su içerisinde %60 (a/h) iodixanol çözeltisi (steril)
L-Lizin Monohidroklorür	Sigma-Aldrich	62929-100G-F
Erkek ve Dişi Luer-Lok 1/8 inç ulusal boru dişi, NPT	Cole-Parmer	41507-44
Masterflex L/S Dijital Sürücü	Cole-Parmer	RK-0752-20	Dijital ekranlı perıstaltik pompa
Hassas Borular için Masterflex L/S Easy Load Pompa Başlığı	Cole-Parmer	RK-07514-10
Masterflex Silikon hortum (Platin) L/S 16	Cole-Parmer	96420-16	BioPharm Platin Kürlenmiş Silikon
Omega Membrane LV Centramate Kaseti, 10K	PALL	OS10T02
Optima XE-90 Ultrasantrifüj	Beckman Coulter	A9471
10X PBS Çözeltisi	Thermo-Fisher	BP39-20
Poli(Etilen Glikol) Ortalama Mn 20.0	Sigma-Aldrich	81300-1KG
Slide-a-lyzer Diyaliz Kaseti (Ekstra Dayanıklı), 10.00 MWCO 0,5-3 mL	Thermo-Fisher	66380
Sodyum Hidroksit (Pelet)	Thermo-Fisher	S318-10
Spesifik patojen içermeyen yumurtalar	Kanada Gıda Denetim Ajansı (CFIA)	YOK	Tedarikçi, konuma göre değişiklik gösterecektir
Sükroz	Thermo-Fisher	S5-3
Supracap 50 Derinlik Filtresi	PALL	SC050V10P
Cerrahi Makas	Thermo-Fisher	08-951-5
Sw41Ti Rotoru	Beckman Coulter	331362	Protokol adımları 2.3.1, 2.3.6 ve 2.3.7'de kullanılmıştır.
SX4750 Rotoru	Beckman Coulter	369702
Konik Tabanlı Tüpler için SxX4750 Adaptörü	Beckman Coulter	359472
İnce Duvarlı Ultraclear santrifüj tüpleri (9/16 inç x 3 1/2 inç)	Beckman Coulter	344059
Hortum Sıkıştırma Kelepçesi	PALL	88216
Yardımcı Basınç Göstergeleri	Cole-Parmer	68355-06