Sendai Virüsü Aracılı İnsan Kan Hücrelerinin İndüklenmiş Pluripotent Kök Hücrelere Yeniden Programlanması

Özet

Kaynak: Rim, Y. A., et al. Induced Pluripotent Stem Cell Generation from Blood Cells Using Sendai Virus and Centrifugation. J. Vis. Exp. (2016).

Bu video, Sendai virüsü aracılı yeniden programlama kullanılarak insan periferik kan mononükleer hücrelerinden indüklenmiş pluripotent kök hücrelerin (iPSC'ler) üretilmesini göstermektedir. Viral transkripsiyon faktörleri, pluripotens ağlarını aktive eder ve lineage genlerini baskılayarak hücrelerin bir alt kümesinin adezyon özellikleri kazanmasını ve iPSC kolonilerinin oluşmasını sağlar. Protokol, seçici matriks bağlanması ve günlük ortam yenilemesi yoluyla bu yeniden programlanmış hücreleri zenginleştirir ve sürdürür.

Protokol

Numune toplamıyla ilgili tüm prosedürler, kurumun IRB kılavuzlarına uygun olarak gerçekleştirilmiştir.

1. Sendai Virüsü ile Transdüksiyon

1. Transdüksiyon (Gün 0)
   1. Kan hücrelerini toplayıp 15-ml'lik konik bir tüpe aktarın ve bir hemositometre kullanarak sayın.
   2. Her transdüksiyon için 3 x 10⁵ hücre hazırlayın ve hücreleri RT'de (oda sıcaklığı) 515 x g'de 5 dk santrifüjleyin.
   3. Süpernatantı vakumla uzaklaştırın ve hücreleri 0.5 ml kan hücresi besiyerinde yeniden süspanse edin.
   4. Hücreleri kaplanmamış 24 kuyucuklu bir plakanın bir kuyucuğuna aktarın.
   5. Sendai virüsü karışımını buz üzerinde çözün ve süspanse edilen hücrelere ekleyin. Sendai virüsünü üretici tavsiyelerine göre hücrelere ekleyin.
   6. Plakayı sızdırmazlık filmi ile kapatın ve 30 °C'de 1.150 x g'de 30 dk santrifüjleyin.
   7. Santrifüjden sonra hücreleri %5 CO₂ ortamında 37 °C'de gece boyunca (O/N) inkübe edin.
2. Hücrelerin besleyici matrise aktarılması (Gün 1)
   1. Ertesi gün, 24 kuyucuklu bir plakayı vitronectin ile kaplayın. Vitronectin çözeltisini, nihai konsantrasyon 5 µg/ml olacak şekilde PBS içinde seyreltin. 24 kuyucuklu bir plakanın bir kuyucuğuna 1 ml vitronectin ekleyin ve RT'de en az 1 saat inkübe edin. Kullanmadan önce kaplama çözeltisini uzaklaştırın. Kaplanmış plakalar RT'de 3 gün boyunca saklanabilir.
   2. Hücreleri ve virüsü içeren tüm besiyerini kaplanmış kuyucuğa aktarın.
   3. Kalan hücreleri 0.5 ml taze kan hücresi besiyeri ile toplayın ve hücre içeren kuyucuğa ekleyin.
   4. Plakayı 35 °C'de 1.150 x g'de 10 dk santrifüjleyin.
   5. Santrifüjden sonra süpernatantı uzaklaştırın, 1 ml iPSC besiyeri ekleyin ve hücreleri %5 CO₂ ortamında 37 °C'de O/N olarak muhafaza edin.
3. İkinci hücre aktarımı (Gün 2)
   1. Yeni bir 24 kuyucuklu plakanın kuyucuklarını, adım 1.2.1'de açıklandığı gibi 5 µg/ml vitronectin ile kaplayın. Her transdüksiyon için plakanın bir kuyucuğunu kullanın.
   2. Hücre süspansiyonunu birinci plakadan yeni kaplanmış vitronectin plakasına aktarın.
      NOT: Gerekli değilse, süspansiyon hücreleri uzaklaştırılabilir. Adım 2.3'te belirtilen prosedür, süspansiyon hücreleri ile 2-3 kez tekrarlanabilir. Adımlar tekrarlanırsa, hücreleri hasat edin.
   3. Bu sırada, bakım için birinci plakanın kuyucuğuna 1 ml iPSC (indüklenmiş pluripotent kök hücre) besiyeri ekleyin ve %5 CO₂ ortamında 37 °C'de O/N inkübe edin.
   4. Yapışmış hücreleri 37 °C ve %5 CO₂ ortamında muhafaza edin ve taze iPSC besiyeri ile günlük besiyeri değişimi yapın. Koloniler, transdüksiyondan sonraki 14-21. günlerde ortaya çıkacaktır.
   5. Süspansiyon hücrelerini içeren yeni kaplanmış plakayı 35 °C'de 1.150 x g'de 10 dk santrifüjleyin.
   6. Santrifüjden sonra hücreleri %5 CO₂ ortamında 37 °C'de O/N inkübe edin.
   7. Ertesi gün süpernatantı uzaklaştırın ve taze iPSC besiyeri ile değiştirin.
      NOT: Adım 1.3'te belirtilen prosedür, süspansiyon hücreleri ile 2-3 kez tekrarlanabilir. Adımlar tekrarlanacaksa, süpernatanttaki hücreleri hasat edin ve adım 1.3'ü tekrarlayın.
   8. Yapışmış hücreleri, %80 konfluens seviyesine ulaşana kadar günlük besiyeri değişimleri ile muhafaza edin.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Plastik Malzemeler
50 ml Konik Tüp	SPL	50050
15 ml Konik Tüp	SPL	50015
10 ml Tek Kullanımlık Pipet	Falcon	7551
5 ml Tek Kullanımlık Pipet	Falcon	7543
12 kuyucuklu Plaka	TPP	92012
24 kuyucuklu Plaka	TPP	92024
iPSC Üretim ve Kültür Malzemeleri
CytoTune-iPSC Sendai Reprogramming Kit	Life Technologies	A16518
TeSR-E8 Medyumu	STEMCELL Technologies	5940	iPSC medyumu
Vitronectin	Life Technologies	A14700
TrypLE express (TrypLE)	Life Technologies	12604-039
ReleSR	STEMCELL Technologies	12604-039	Koloni ayırma çözeltisi