Streptavidin Bloklama Deneyi ile İnfluenza Virüsü İçselleştirmesinin Analizi

Özet

Kaynak: Pohl, M. O. & Stertz, S. Measuring Attachment and Internalization of Influenza A Virus in A549 Cells by Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (2015)

Bu video, insan akciğer epitelyal hücrelerinde yüzeye bağlı influenza virüsünü hücre içine alınmış virüsten ayırt etmek için streptavidin bloklama analizinin kullanımını göstermektedir. Floresan sinyallerinin karşılaştırılması, inkübasyon sonrası daha yüksek bir yoğunluğun başarılı viral internalizasyonu gösterdiğini ortaya koymaktadır.

Protokol

1. Tutunma/İçselleştirme Deneyi

NOT: Analize başlamadan önce tüm reaktiflerin hazırlandığından emin olun. Sonuçlar bölümünde sunulan üç kontrol grubu (yalancı enfekte hücreler, nöraminidaz ile ön işlem görmüş hücreler ve sodyum azid ile işlem görmüş hücreler) için protokolde küçük değişiklikler yapılması gerekmektedir.

1. Her biri 200,000 A549 hücresi içeren 16 derin kuyulu tüp hazırlayın. 4 tüpten oluşan deneysel setin yanında, her biri 4 tüp gerektiren 3 kontrol durumu bulunmaktadır: yalancı enfekte hücreler, nöraminidaz (NA) ile ön işlem görmüş hücreler ve sodyum azid ile işlem görmüş hücreler. Her grup; ‘0 dk’, ‘0 dk + streptavidin (STV)’, ‘30 dk’ ve ‘30 dk + STV’ olarak etiketlenmiş 4 tüpten oluşur.
2. Tüpleri 4 °C'de 3 dk boyunca 450 x g'de santrifüjleyin. Süpernatantı uzaklaştırın ve pellet'i 200 µl fosfat tamponlu salin (PBS) içinde yeniden süspande edin.
3. Tüpleri 4 °C'de 450 x g'de santrifüjleyin. Süpernatantı uzaklaştırın ve pellet'i %0,3 sığır serum albümini (BSA), 20 mM 4-(2-hidroksietil)-1-piperazinetansülfonik asit (HEPES) ve %1 penisilin-streptomisin içeren 200 µl Dulbecco modifiye Eagle besiyeri (DMEM) (inkübasyon besiyeri) içinde yeniden süspande edin. 37 °C'de 30 dk inkübe edin.
   NOT: Nöraminidaz kontrolü için: Hücreleri yeniden süspande etmek için inkübasyon besiyerinde seyreltilmiş 200 mU/ml konsantrasyonda bakteriyel nöraminidaz (örneğin Vibrio cholera kaynaklı sialidaz) kullanın.
4. Tüpleri 4 °C'de 3 dk boyunca 450 x g'de santrifüjleyin. Süpernatantı uzaklaştırın ve pellet'i 200 µl PBS içinde yeniden süspande edin. Bu adımı bir kez daha tekrarlayın, ardından tüpleri buz üzerinde 10 dk boyunca soğutun.
5. Tüpleri 4 °C'de 3 dk boyunca 450 x g'de santrifüjleyin. Süpernatantı uzaklaştırın ve pellet'i 100 µl biotinli virüs (bölüm 2'de belirlenen virüs konsantrasyonunu enfeksiyon-PBS içinde seyrelterek kullanın) içinde yeniden süspande edin. Buz üzerinde 1 sa boyunca inkübe edin.
6. Tüpleri 4 °C'de 3 dk boyunca 450 x g'de santrifüjleyin. Süpernatantı uzaklaştırın ve pellet'i 200 µl PBS içinde yeniden süspande edin. Bu adımı bir kez daha tekrarlayın.
   NOT: Yalancı enfekte kontrolü için: Virüs içermeyen enfeksiyon-PBS kullanın. Sodyum azid kontrolü için: Enfeksiyon-PBS'ye eklenmiş %0,1 sodyum azid ile seyreltilmiş virüs kullanın.
7. Enfeksiyondan sonra numunelerin buz üzerindeki işlemleri:
   1. ‘0 dk’ numuneleri için adım 2.5'i takip edin ve diğer numuneler fikse edilene kadar numuneleri 4 °C'de saklayın.
   2. ‘0 dk + STV’ numuneleri için, tüpleri 4 °C'de 3 dk boyunca 450 x g'de santrifüjleyin. Süpernatantı uzaklaştırın ve pellet'leri %2 BSA ve %0,1 sodyum azid içeren (numune işleme sırasında internalizasyonu önlemek için) PBS'de seyreltilmiş 50 µl STV (bölüm 3'te belirlenen konsantrasyonu kullanın) içinde yeniden süspande edin. Buz üzerinde 30 dk inkübe edin.
   3. Tüpleri 4 °C'de 3 dk boyunca 450 x g'de santrifüjleyin. Süpernatantı uzaklaştırın ve pellet'i 200 µl PBS içinde yeniden süspande edin. Bu adımı bir kez daha tekrarlayın.
   4. Fiksasyon için, tüpleri 4 °C'de 3 dk boyunca 450 x g'de santrifüjleyin. Süpernatantı uzaklaştırın ve pellet'i 100 µl %3,7 paraformaldehit (PFA) içinde yeniden süspande edin. Oda sıcaklığında (RT) 10 dk inkübe edin. Ardından, 1.6'da açıklanan yıkama adımını tekrarlayın ve numuneleri 4 °C'de saklayın.
   5. ’30 dk’ numuneleri için, tüpleri 4 °C'de 3 dk boyunca 450 x g'de santrifüjleyin. Süpernatantı uzaklaştırın ve pellet'i %2 BSA içeren 200 µl PBS içinde yeniden süspande edin. 37 °C'de 30 dk inkübe edin. 1.7.3-1.7.4 adımlarını takip edin ve numuneleri 4 °C'de saklayın.
      NOT: Sodyum azid kontrolü için: 37 °C'deki 30 dakikalık inkübasyon için %2 BSA ve %0,1 sodyum azid eklenmiş PBS kullanın.
   6. ’30 dk + STV’ numuneleri için tüpleri 4 °C'de 3 dk boyunca 450 x g'de santrifüjleyin. Süpernatantı uzaklaştırın ve pellet'i %2 BSA içeren 200 µl PBS içinde yeniden süspande edin. 37 °C'de 30 dk inkübe edin. Ardından, tüpleri 4 °C'de 3 dk boyunca 450 x g'de santrifüjleyin. Süpernatantı uzaklaştırın ve pellet'leri %2 BSA ve %0,1 sodyum azid içeren (numune işleme sırasında internalizasyonu önlemek için) PBS'de seyreltilmiş 50 µl STV (bölüm 3'te belirlenen konsantrasyonu kullanın) içinde yeniden süspande edin. Buz üzerinde 30 dk inkübe edin. 1.7.3-1.7.4 adımlarını takip edin ve numuneleri 4 °C'de saklayın.
      NOT: Sodyum azid kontrolü için: 37 °C'deki 30 dakikalık inkübasyon için %2 BSA ve %0,1 sodyum azid eklenmiş PBS kullanın.
8. Permeabilizasyon için, tüpleri 4 °C'de 3 dk boyunca 450 x g'de santrifüjleyin. Süpernatantı uzaklaştırın ve pellet'i %0,5 Triton X-100 içeren 100 µl PBS içinde yeniden süspande edin. Oda sıcaklığında (RT) 6 dk inkübe edin. Ardından, 1.6'da açıklanan yıkama adımını tekrarlayın.
9. Tüpleri 4 °C'de 3 dk boyunca 450 x g'de santrifüjleyin. Süpernatantı uzaklaştırın ve pellet'i STV-Cy3 içeren PBS'de seyreltilmiş 50 µl %2 BSA içinde yeniden süspande edin. (Lütfen unutmayın, uygun STV-Cy3 konsantrasyonu deneye başlamadan önce belirlenmelidir. 1:200 konsantrasyonu ile başlayın ve 1:2,400'e kadar 2 katlı seyreltmeleri test edin. Bizim çalışmalarımızda 1:1,000 seyreltme optimal olarak kanıtlanmıştır.)
10. Oda sıcaklığında (RT) karanlıkta 1 sa boyunca inkübe edin. Ardından, 1.6'da açıklanan yıkama adımını tekrarlayın ancak pellet'i PBS'de seyreltilmiş 200 µl %2 BSA içinde yeniden süspande edin.
11. Numuneleri akış sitometrisi ile analiz edin. Her numunedeki Cy3-pozitif hücrelerin yüzdesini belirleyin.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
DMEM	Life Technologies	41966-052
FBS	Life Technologies	10270-106
Penisilin-Streptomisin	Life Technologies	15140-163
PBS	Life Technologies	14190-169
BSA	VWR Calbiochem	126579
HEPES	Life Technologies	15630-100
D-Sükroz	Fluka	84100
Bio Rad Protein Bio Assay	Bio Rad	500-0006
Derin kuyucuklu tüpler (1.2 ml mikrotüpler)	Milian	82 00 001
PFA	Lucerna chem Electron microscopy sciences	15710
Ultrasantrifüj tüpleri	Hemotec HmbH	253070
Triton X-100	Fluka	93420
STV-Cy3	Life Technologies	43-4315
STV	Life Technologies	43-4302
Sodyum azid	Fluka	71290
Bakteriyel nöraminidaz/sialidaz	Sigma-Aldrich	N6514-1UN