Optik Yoğunluk Ölçümleri Kullanılarak Faj Aracılı Bakteriyel Büyüme İnhibisyonunun Değerlendirilmesi

Özet

Kaynak: Niu, Y. D., ve ark. Bacteriophage Effectiveness for Biocontrol of Foodborne Pathogens Evaluated via High-Throughput Settings. J. Vis. Exp. (2021)

Bu video, E.coli bakteri kültürlerine karşı faj kokteyllerinin litik aktivitesini değerlendirmek için mikroplaka tabanlı bir analizi göstermektedir. Optik yoğunluktaki değişikliklerin, faj gücünü ve bakterilerin tamamen inhibe edilmesi için gereken konsantrasyonu nasıl ortaya çıkardığını vurgulamaktadır

Protokol

1. Tampon ve reaktiflerin hazırlanması

1. 50 mL triptik soya suyu (TSB) hazırlayın (15 g TSB tozu ve 50 mL ultra saf su) ve otoklavlayın.
   NOT: Bu, oda sıcaklığında 3 aya kadar veya 4 °C'de 6 aya kadar saklanabilir.
2. 500 mL triptik soya agarı (TSA) hazırlayın (20 g TSA tozu ve 50 mL ultra saf su) ve otoklavlayın.
   NOT: Bu, 4 °C'de 3 aya kadar saklanabilir.
3. 50 mL Fosfat Tamponlu Salin (PBS; 4 g NaCl, 0.1 g KCl, 0.77 g Na₂HPO₄ ve 0.12 g KH₂PO₄, 500 mL ultra saf su) hazırlayın, 25 °C'de pH'ı ölçüp 7.2 ± 0.2'ye ayarlayın ve otoklavlayın.
   NOT: Bu, 4 °C'de 6 aya kadar saklanabilir.
4. 20 mL 1 M MgSO₄ hazırlayın (49.294 g ve 20 mL ultra saf su) ve 0.2 µm polietersulfon filtre ile sterilize edin.
5. 10 mM MgSO₄ içeren 500 mL TSB (mTSB; 15 g TSB tozu, 50 mL ultra saf su ve 5 mL 1 M MgSO₄) hazırlayın ve otoklavlayın; otoklavlanan medyumun oda sıcaklığına soğumasını bekleyin. Aseptik teknik uygulayın. Bir serolojik pipet kullanarak dikkatlice 5.0 mL 1 M MgSO₄ aktarın; karıştırmak için hafifçe çalkalayın.

2. Bakteri kültürünün hazırlanması

1. Bakteriyel Araştırma Laboratuvarı Kültürü (BRLC) hazırlamak için, gliserol stok tüplerini dondurucu envanterinden çıkarın ve laboratuvara transfer edin.
2. Tek kullanımlık bir ekim özesi veya eşdeğeri kullanarak tüpe daldırın, bir miktar inokulum (donmuş çamur) alın ve seviye II biyolojik güvenlik kabini içinde bir TSA plağına veya eşdeğerine ekim yapın. Plağı 37 ± 2 °C'de 15−18 sa boyunca inkübe edin.
3. Hazırlanan BRLC plaklarını poşetleyin ve 4 °C'de saklayın.
   NOT: BRLC için genel son kullanma süresi: oluşturulduktan sonra 4 °C'de 14 gündür.
4. Test edilecek her bir E. coli O157 suşunun BRLC plaklarından tek bir kolonisini 10 mL TSB'ye inoküle edin ve 9 log10 CFU/mL seviyesine ulaşmak için 37 °C'de 18 sa boyunca statik olarak inkübe edin.
5. Gece boyunca inkübe edilen kültürlerin (ertesi sabah), her bir E. coli O157 suşu için 10 mM MgSO₄ içeren mTSB kullanarak 4-5 log10 CFU/ml (veya istenen diğer inokulum seviyesi) elde edecek şekilde seri dilüsyonunu hazırlayın.
6. Bakteriyel karışımı hazırlamak için, her bir suşun gece boyunca inkübe edilen kültüründen toplamda 4-5 log10 CFU/mL (veya istendiği gibi) elde edecek şekilde eşit hacimlerde karıştırın.
7. Seyreltilmiş bakteriyel kültürü, kullanım için bekletilmek üzere hemen 4 °C'ye yerleştirin.
8. İnokulum kültürünü 10 veya 10 kat seyreltin ve izole koloniler elde etmek için bu dilüsyonların 0.1 mL'lik alikotlarını TSA plaklarına ekin.

3. Faj çalışma çözeltilerinin hazırlanması

1. Standart yöntemleri4 takip ederek, taranacak her bir faj için yüksek titreli çalışma stokları (≥108 PFU/mL) üretin.
   NOT: Faj stoklarının genel son kullanma süresi, üretimden sonra 4 °C'de plastik bir şişede 3 aydır.
2. Lizis kinetiği için örneğin ~10⁸ PFU/mL gibi istenen titreye ulaşmak için, münferit faj preparatlarını 10 mM MgSO₄ içeren mTSB ile seyreltin. Aynı titreye sahip her bir çalışma stokunun eşit hacimlerini tüm olası kombinasyonlarda karıştırarak faj kokteyllerini hazırlayın.

4. Tekil fajlar ve faj kokteylleri için in-vitro lizis kinetiğinin hazırlanması

1. Mikroplaka analizini kurmak için, steril 96 kuyucuklu mikroplakalarda 1-8. sütunlardaki her bir fajın seri 10 katlı dilüsyonlarını hazırlayın.
   NOT: Tek bir bakteri suşuna karşı dört faj, her plakta bitişik sütunlarda çift örnekli olarak test edilebilir. Kalan dört sütun, faj içermeyen kontroller ve mTSB kör kontrolü için ayrılmıştır (Şekil 1).
2. 96 kuyucuklu mikroplakanın 1. ile 12. sütunları arasındaki kuyucuklara 180 µL mTSB ekleyin.
3. Mikroplakanın üst sırasındaki (A Sırası) 1-8 numaralı kuyucuklara 20 µL dilüe edilmiş bireysel fajlar veya faj kokteylleri (~108 PFU/mL) ekleyin.
4. Fajsız ve kör kontrol için, 9, 10 ve 1. sütunların üst kuyucuklarına 20 µL mTSB ekleyin.
5. 12 kanallı bir pipet ile plakayı dilüe edin. Sıradan sıraya 20 µL transfer edin. İçeriği, yumuşak ve tekrarlayan aspirasyon, püskürtme (en az beş kez) ve dilüsyonlar arasında uç değiştirme yoluyla iyice karıştırın. Son sıradan (H Sırası) 20 µL çıkarın.
   NOT: Çapraz kontaminasyonu önlemek için filtreli uçlar kullanılması önerilir.
6. Her suş için bir rezervuar hazırlayın. Dilüe edilmiş kültürden 2-3 mL'yi rezervuara aktarmak için 1 mL'lik bir pipet kullanın. 1-10. sütunlar için, her kuyucuğa 20 µL dilüe edilmiş bakteri kültürünü eklemek üzere çok kanallı bir pipet kullanın. Her ekleme arasında uçları değiştirin.
7. Mikroplakayı kapatın ve istenen koşullarda inkübe edin (örneğin, 37 °C'de 10 saat veya 22 °C'de 2 saat).
8. 2. saatte veya diğer istenen aralıklarda, mikroplakaları inkübatörden çıkarın.

Sonuçlar

Şekil 1: 96 kuyucuklu mikroplaka analizinin önerilen düzeni. Her bir faja ait seri 10 katlı dilüsyonlar, steril 96 kuyucuklu mikroplakaların 1-8. sütunlarında hazırlanır. Bir bakteri suşuna karşı dört farklı faj, her plakada yan yana gelen sütunlarda çift kopya (duplicate) şeklinde test edilebilir. Kalan sütunlar kontroller içindir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Gerekli malzemeler, reaktifler ve ekipmanlar
Magnezyum sülfat heptahidrat	Sigma	1374361
Pipet-Lite LTS Pipet L-10XLS+	METTLER TOLEDO	17014382
Pipet-Lite LTS Pipet L-30XLS+	METTLER TOLEDO	17014405
Pipet-Lite Çok Kanallı Pipet L12-20XLS+	METTLER TOLEDO	17013808
Pipet-Lite Pipet, Unv. SL-20XLS+	METTLER TOLEDO	17014412
Pipet Uçları RT LTS 1000µL FL 768A/8-düşük tutunumlu	METTLER TOLEDO	30389213
Pipet Uçları SR LTS 20µL F 960A/5	METTLER TOLEDO	17005860
Rezervuar	METTLER TOLEDO	89094-662
Kapaklı, steril, şeffaf, 96 kuyucuklu, düz dipli polistiren mikroplakalar	Fisher	168055
Triptik soya agar (TSA)	Sigma	105458-0500
Triptik soya suyu (TSB)	Sigma	105459-0500
T-Şekilli Hücre Yayma Çubukları	VWR	76299-566
Enstrümanlar
Kompakt Mikrobiyolojik İnkübatörler	Fisher	5012590H
Poligon Karıştırma Çubukları	Fisher	14-512-125	uzunluk: 20 mm
Synergy Neo2 Hibrit Çok Modlu Okuyucu	Fisher	BTNEO2M
Yazılım
SAS	SAS Institute	9.4