Replike HSV-1 Genomlarının Bir Nükleozid Analogu ile İşaretlenmesi

Özet

Kaynak: Dembowski, J. A., Deluca, N. A. Purification of Viral DNA for the Identification of Associated Viral and Cellular Proteins. J. Vis. Exp. (2017)

Bu video, durağan fazdaki memeli hücrelerin HSV-1 (Herpes Simplex Virus-1) ile enfekte edilmesini ve ardından konakçı ile viral replikasyon mekanizmaları kullanılarak viral genomun replikasyonunu göstermektedir. Replikasyon halindeki genomları işaretlemek için yeni sentezlenen viral DNA'ya sentetik bir nukleozid analoğu dahil edilir; bu genomlar daha sonra ilişkili konakçı ve viral proteinlerin proteomik analizi için izole edilir.

Protokol

1. Hücre Kültürü, Viral Enfeksiyon ve EdC (5-Etinil-2′-deoksisitidin) İşaretlemesi (Şekil 1)

Aşağıdaki protokol virüslerle çalışmayı içermektedir. Lütfen virüslerin ve diğer biyolojik ajanların güvenli kullanımıyla ilgili olarak kurumunuzun biyogüvenlik protokollerine başvurun. Bu protokol, University of Pittsburgh Kurumsal İnceleme Kurulu tarafından onaylanmıştır.

1. Konfluen hale gelmiş 150 cm² doku kültürü flaskındaki MRC-5 (Medical Research Council hücre suşu 5) hücrelerini tripsinizleyin ve hücreleri, 100 mL DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) artı %10 FBS içeren 600 cm2 doku kültürü plakasına aktarın. Konfluens ve durağan faza ulaşmak için %5 CO₂ varlığında 37 °C'de 3 - 4 gün inkübe edin. Konfluen bir 600 cm2 kap ~7 x 10⁷ hücre içerir. Her koşul için 1 plaka ve her bir karşılık gelen negatif kontrol için 1 plaka hazırlayın.
   NOT: Sadece vDNA'nın (viral DNA) işaretlenmesini ve sonraki adımlarda saflaştırılmasını sağlamak amacıyla hücresel DNA replikasyonunu inhibe etmek için hücreler durağan faza ulaşmalıdır.
   NOT: Her örnek, EdC eklenmeden aynı enfeksiyon koşulları ve zaman noktası kullanılarak hazırlanan tamamlayıcı bir işaretlenmemiş negatif kontrol gerektirir.
   NOTE: Benzer hücre büyümesi, enfeksiyon, EdC işaretleme koşulları ve zaman noktaları kullanılarak görüntüleme yoluyla hücresel DNA'nın işaretlenmesini test etmek için bu deneyin ölçeği küçültülmüş bir versiyonu eş zamanlı olarak yürütülmelidir (bkz. Adım 2).
2. 7 x 10⁸ PFU (plak oluşum birimi) HSV-1'i 7 mL soğuk Tris-Tamponlu Salin (TBS) içinde seyreltin. Büyüme ortamını uzaklaştırın ve 37 °C'de saklayın. Enfekte etmek için, 7 mL seyreltilmiş virüsü MRC-5 hücrelerine ekleyin ve oda sıcaklığında 1 saat boyunca sallayın. Adsorpsiyonun ardından inokulumu uzaklaştırın, 50 mL oda sıcaklığındaki TBS ile durulayın ve orijinal büyüme ortamını tekrar ekleyin. %5 CO₂ varlığında 37 °C'de inkübe edin. Bu adım, her deneysel koşul ve negatif kontrol için uygulanmalıdır.
   NOT: Viral dUTPase (UL50 geni) ve/veya urasil glikozilaz (UL2 geni) ekspresyonu kusurlu HSV-1 mutantları kullanılarak artırılmış EdC işaretlemesi sağlanabilir. HSV-1 dUTPase düşük substrat spesifitesine sahiptir ve birçok nukleozid analoğunun aktivasyonunu azaltabilir.
3. Viral genomları EdC ile işaretleyin. Gelen genomların (1.3.1.), replike olan genomların (1.3.2.) veya viral replikasyon çatallarının (1.3.3.) işaretlenmesi için talimatları izleyin.
   NOT: Sonraki adımlarda sırasıyla gelen genomların, replike olan genomların veya replikasyon çatallarının analiz edilip edilmeyeceğine bağlı olarak yalnızca Adım 1.3.1, 1.3.2 veya 1.3.3 uygulanmalıdır.
   NOT: EdC yerine EdU veya f-ara EdU kullanılabilir. Nukleozid analoglarının toksisitesi izlenmeli ve minimize edilmelidir.
   1. Adım 1.2'deki enfeksiyonu gerçekleştirmek için önceden işaretlenmiş stokları kullanın ve replike olmamış vDNA'yı incelemek için enfeksiyondan sonraki 4 saat (hpi) içinde Adım 2 veya 3'e geçin (Şekil 1A).
      NOT: Önceden işaretlenmiş virüs stoklarını daha önce tanımlanan protokol25'i kullanarak hazırlayın. Herhangi bir kalıntı EdC'yi uzaklaştırmak için virüs stokları bir G-25 kolonundan geçirilmelidir.
   2. Enfekte hücrelerin hücre kültürü ortamına 2 - 4 saat boyunca 5 - 25 µM EdC ekleyerek replike olan vDNA'yı işaretleyin (Şekil 1B). Eklemeden önce, EdC'yi 1 mL büyüme ortamında seyreltin.
   3. Viral replikasyon çatallarını işaretlemek için, vDNA replikasyonunun başlangıcından sonra (≥4 hpi), replike olan vDNA'yı 5-20 dakika boyunca 5 - 25 µM EdC ile pulse işaretleme yapın. Chase işlemi için, 25 - 100 µM 2´deoksisitidin (deoksiC) içeren chase ortamı ile 3 kez durulayın ve ardından chase ortamı varlığında ek 20-40 dakika daha inkübe edin (Şekil 1C).
      NOT: Pulse ve chase ortamları kullanımdan önce 37 °C ve %5 CO₂'ye dengelenmelidir.
      NOT: Pulse-chase deneyleri için, nukleozidlerin hücreye girmesi ve replike olan DNA'ya entegre edilebilmeden önce fosforillenmesi için geçen süreyi dikkate almak önemlidir. Bu süre ampirik olarak belirlenmelidir.
      NOT: Pulse-chase deneylerinin çözünürlüğünü belirlemek için, kullanılan deneysel koşullar altındaki viral replikasyon hızını hesaplayın. Bu, tek aşamalı büyüme zaman seyri sırasında viral genomların kantitatif PCR'ı ile belirlenebilir.

Sonuçlar

Şekil 1: HSV-1 DNA'sını işaretleme yaklaşımları. (A) Giren virüsün durumunu analiz etmek için, G0 evresindeki dinlenme halindeki MRC-5 hücreleri önceden işaretlenmiş HSV-1 ile enfekte edilir ve replike olmamış viral DNA'yı i...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
MRC-5 hücreleri	ATCC	CCL-171
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	26140-179
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	12800-082	%10 FBS, 2 mM L-glutamin, 12 mM (flasklarda büyüme için) veya 30 mM (kaplarda büyüme için) sodyum bikarbonat ile desteklenmiştir
600 cm² doku kültürü kabı	Thermo Fisher Scientific	166508
Tris Tamponlu Salin (TBS), pH 7.4			137 mM NaCl, 5 mM KCl, 491 mM MgCl, 680 mM CaCl, 25.1 mM Tricine
HSV-1 stoğu			1x109 PFU/mL'den daha yüksek titreli stoklar en iyi sonucu verir
5´-Ethynyl-2´-deoxycytidine (EdC)	Sigma-Aldrich	T511307	40 mM stok hazırlamak için DMSO içinde çözün, alikotlayın ve -20 °C'de saklayın
Hücre kültürü inkübatörü
Biyogüvenlik kabini
Isıtıcı bloklar			65 °C ve 95 °C