Viral DNA-Protein Komplekslerinden Proteinlerin İzolasyonu

Özet

Kaynak: Dembowski, J. A., et al. Purification of Viral DNA for the Identification of Associated Viral and Cellular Proteins. J. Vis. Exp. (2017).

Bu video, klik kimyası ve manyetik boncuk saflaştırması kullanarak hücre çekirdeklerinden protein-viral DNA komplekslerinin izolasyonunu göstermektedir. Protokol; viral genomların alkin-modifiyeli nükleotidlerle işaretlenmesini, bir klik reaksiyonu aracılığıyla biyotinilasyonu ve streptavidin kaplı manyetik boncuklara bağlanmayı içerir. Yıkama ve ısı ile elüsyondan sonra, saflaştırılmış kompleksler toplanır, şok dondurulur ve sonraki analizler için saklanır.

Protokol

1. vDNA ve İlişkili Proteinlerin Saflaştırılması

NOT: Tüm tamponlar ve reaktifler kullanım öncesinde buz üzerinde soğutulmalı ve aksi belirtilmedikçe tüm adımlar buz üzerinde gerçekleştirilmelidir.

1. Çekirdeklerin toplanması. NOT: Çekirdek izolasyonundan önce, proteinlerin DNA'ya çapraz bağlanması için formaldehit kullanılabilir. Bu durumda, streptavidin kaplı boncuklar üzerinde DNA saflaştırması sırasında daha stringent yıkama koşulları uygulanabilir.
   1. Büyütme ortamını 20 mL çekirdek ekstraksiyon tamponu (NEB) ile değiştirin ve ara sıra sallayarak 4 °C'de 20 dk inkübe edin. Çekirdekler mikroskop altında görünür hale gelecektir.
   2. Çekirdekleri bir hücre kazıyıcı kullanarak plakadan kazıyın ve 50 mL'lik konik bir tüpe aktarın. Çekirdekleri çöktürmek için 4 °C'de 2.50 x g'de 10 dk santrifüjleyin, süpernatantı atın.
      NOT: Hücrelerden çekirdek izolasyonunu doğrulamak için trypan mavi boyaması kullanılabilir.
   3. Nükleer pellet'i 10 mL fosfat tamponlu salin (PBS) içinde nazikçe çözün, 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın ve 4 °C'de 2.50 x g'de 10 dk santrifüjleyerek çöktürün. PBS'yi tamamen uzaklaştırın.
      NOT: Çekirdekler dondurulabilir ve protokol bu noktada durdurulabilir. Bunun için, nükleer pellet'i nazikçe 50 µL dondurma tamponu içinde resüspande edin ve tüpü bir etanol/kuru buz banyosunda inkübe edin. Dondurulmuş çekirdekleri -80 °C'de saklayın. Kullanmadan önce çekirdekleri oda sıcaklığında çözdürün, hızla buza aktarın, 10 mL PBS ekleyin, karıştırmak için nazikçe sallayın, 4 °C'de 2.50 x g'de 10 dk santrifüjleyerek çöktürün ve PBS'yi tamamen uzaklaştırın. Çekirdeklerin dondurulması verimin düşmesine neden olabilir.
2. Biyotin-azidin 5-etinil-2′-deoksisitidin (EdC) işaretli viral DNA'ya veya vDNA'ya kovalent olarak konjugasyonu.
   1. Nükleer pellet'i, 10 mL'lik bir pipetle 5 kez nazikçe yukarı-aşağı pipetleyerek 10 mL klik reaksiyon karışımında [bkz. Malzemeler Tablosu] resüspande edin.
      NOT: Klik reaksiyon karışımındaki reaktiflerin belirtilen sırada eklenmesi önemlidir.
   2. 4 °C'de 1 saat boyunca döndürün. Döndürme işlemi sırasında B1, B2 ve B3 tamponlarını [bkz. Malzemeler Tablosu] hazırlayın ve soğutun.
   3. Çekirdekleri 4 °C'de 2.50 x g'de 10 dk santrifüjleyerek çöktürün. Klik reaksiyon karışımını tamamen uzaklaştırın ve pellet'i 10 mL PBS içinde nazikçe resüspande edip 4 °C'de 2.50 x g'de 10 dk santrifüjleyerek yıkayın.
   4. Nükleer pellet'i nazikce 1 mL PBS içinde resüspande edin ve geniş ağızlı bir pipet ucu kullanarak 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Çekirdekleri 4 °C'de 2.50 x g'de 10 dk santrifüjleyerek çöktürün. PBS'yi tamamen uzaklaştırın ve sıvı azot ile şok dondurun.
      NOT: Protokol bu noktada durdurulabilir ve dondurulmuş çekirdekler -80 °C'de saklanabilir. Dondurma-çözme işlemi sonraki lizise yardımcı olur, bu nedenle aynı gün Adım 1.3'e geçilecek olsa bile çekirdeklerin şok dondurulması önerilir.
3. Çekirdeklerin lizlenmesi ve DNA'nın fragmente edilmesi.
   1. Çekirdekleri buz üzerinde çözdürün ve yukarı-aşağı pipetleyerek 50 µL Tampon B1 içinde resüspande edin. Buz üzerinde 45 dk inkübe edin.
   2. Numuneleri, 3 mm'lik bir mikro-uç probu kullanarak %40 amplitudda, her biri 30 sn olmak üzere 6 kez sonike edin. Pulslar arasında numuneleri 30 sn boyunca buz üzerinde tutun. Sonikasyondan sonra numuneler bulanık değil, berrak görünmelidir.
      NOT: Sonikasyon koşulları, kullanılan sonikatörlere göre optimize edilmelidir.
   3. Hücre kalıntılarını 4 °C'de 14.0 x g'de 10 dk santrifüjleyerek çöktürün. Pellet boyutu önemli ölçüde azalmalıdır. Süpernatantı 10 µM'lik bir hücre süzgecinden filtreleyin ve süzülen kısmı saklayın.
   4. Filtrelenmiş süpernatanta 50 µL Tampon B2 ekleyin. Bu numunenin 90 µL'si Adım 1.4.2'de kullanılacaktır.
   5. DNA izolasyonu için her koşuldan bir alikot (50 µL veya hacmin 1/20'si) alın ve 50 µL 2x sodyum dodecil sülfat (SDS)-bikarbonat çözeltisi [bkz. Malzemeler Tablosu] ekleyin. DNA izolasyon protokolüne geçin.
   6. Giriş proteini için her koşuldan bir alikot (50 µL veya hacmin 1/20'si) alın, 50 µL 2x Laemmli örnek tamponu ekleyin, sıvı azotta dondurun ve -80 °C'de saklayın.
4. Biyotillendirilmiş DNA'nın streptavidin kaplı boncuklara bağlanması.
   1. 30 µL boncuk süspansiyonunu 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktararak Streptavidin T1 manyetik boncuklarını hazırlayın. Numune başına bir tüp boncuk hazırlayın. Boncukları resüspande etmek için vorteksleyerek, boncukları ayırmak için mıknatıs uygulayarak ve yıkama tamponunu aspire ederek 1 mL Tampon B2 ile 3 kez yıkayın.
      NOT: Optimize edilmiş bağlanma koşulları, maksimum verim ve minimum arka plan bağlanması sağlar. Deneysel olarak, Streptavidin T1 manyetik boncuklarının, agaroz boncuklardan ve diğer Streptavidin boncuklarından önemli ölçüde daha yüksek bağlanma kapasitesine sahip olduğu ve Streptavidin C1 boncuklarından daha az arka plan bağlanması yaptığı belirlenmiştir (Şekil 1A).
   2. Adım 1.3.4'teki numunenin 90 µL'sini yıkanmış boncuklara ekleyin ve 4 °C'de gece boyunca döndürün.
      Not: Numune eklendikten sonra boncukları vortekslemeyin.
      NOT: İşaretlenmemiş negatif kontrolde önemli miktarda DNA veya protein izole edilirse, arka plan bağlanmasını azaltmak için bu adım gece boyu yerine 4 saate indirilebilir.
5. Boncukların yıkanması ve vDNA ile ilişkili proteinlerin elüsyonu.
   NOT: Kalan adımlar için filtre uçların kullanılması önerilir.
   1. Numuneleri manyetik mikrosantrifüj tüp rafına yerleştirin, süpernatantı uzaklaştırın, 1 mL Tampon B2 içinde nazikçe resüspande edin ve 4 °C'de 5 dk döndürün.
   2. Adım 1.5.1'i üç kez tekrarlayın.
   3. Numuneleri manyetik mikrosantrifüj tüp rafına yerleştirin, süpernatantı uzaklaştırın, 1 mL Tampon B3 içinde nazikçe resüspande edin ve 4 °C'de 5 dk döndürün.
   4. Bağlı DNA izolasyonu için 10 µL boncuk karışımını (hacmin 1/10'u) yeni bir tüpe aktarın. Bu tüpe mıknatıs uygulayın, süpernatantı uzaklaştırın, boncukları 10 µL 1x sodyum dodecil sülfat veya SDS-bikarbonat çözeltisi içinde resüspande edin ve DNA izolasyon protokolüne geçin.
   5. Adım 1.5.3'ten kalan 90 µL boncuk karışımını içeren tüpe mıknatıs uygulayın, süpernatantı uzaklaştırın ve protein ile DNA-protein komplekslerini elüe etmek için boncukları 50 µL 2x Laemmli örnek tamponu içinde resüspande edin.
   6. Numuneleri 95 °C'de 15 dk kaynatın, vorteksleyin, mikrosantrifüjde hızla çevirin ve mıknatıslan uygulayın. Elüatı yeni bir tüpe aktarın, şok dondurun ve -80 °C'de saklayın.
      NOT: Kaynatma sırasında tüplerin açılmadığından emin olmak için kapak kilidini kullanın.
      NOT: Protokol bu noktada durdurulabilir ve numuneler birkaç hafta boyunca -80 °C'de saklanabilir.
   7. Protein numunelerini standart prosedürlerle Coomassie Blue boyama, western blotting veya kütle spektrometrisi ile analiz edin. Temsili sonuçlar Şekil 1 ve Şekil 2'de gösterilmiştir.
      NOT: Protein veriminin kütle spektrometrisi için yeterli olup olmadığını belirlemek için, her numunenin 7,5 µL'si Coomassie Blue boyama ile analize ve 7,5 µL'si temsili bir viral genom ilişkili proteinin (ICP4, ICP8 veya UL42) western blotting analizine kullanılır. Giriş protein seviyelerini kontrol etmek için Adım 1.3.6'daki lizatlardan aynı hacimde numuneler yan yana koşturulur. Kalan numune (35 µL) daha sonra kütle spektrometrisi ile analiz edilir.

Sonuçlar

Şekil 1: Temsili protein saflaştırma sonuçları. (A) Saflaştırma adımları birkaç farklı tipte streptavidin kaplı boncuk kullanılarak gerçekleştirildiğinde protein veriminin karşılaştırılması. Protein verimini karşılaştırmak için enfeksiyon EdC varlığında (+), arka plan bağlanmasını karşılaştırmak için ise EdC yokluğunda (-) gerçekleştirildi. Enfeksiyonlar ve EdC etiketlemesi yapıldı, ve DNA-protein kompleksleri, farklı tipteki streptavidin kaplı boncukların benzer miktarları kullanılarak saflaştırıldı. Üst panel: Streptavidin kaplı agaroz boncuklar veya Streptavidin M-280 ile saflaştırma sonrası protein veriminin karşılaştırılması. Alt panel: Streptavidin M-270, M-280, Streptavidin C1 veya Streptavidin T1 ile saflaştırma sonrası protein veriminin karşılaştırılması. Western blotting, viral ICP4 proteinine karşı bir antikor ile gerçekleştirildi. Karşılaştırma amacıyla ilk şeritte saflaştırılmış ICP4 gösterilmiştir. Alt paneldeki 280 şeridinde, üst paneldekiyle benzer bir ICP4 yoğunluğu gözlemlemek için daha uzun pozlama gerekti. (B) EdC etiketleme süresinin bir fonksiyonu olarak temsili protein saflaştırma sonuçları gösterilmiştir. Enfeksiyonlar ve EdC etiketlemesi yapıldı ve DNA-protein kompleksleri Streptavidin T1 boncukları kullanılarak saflaştırıldı. EdC etiketlemesi 0, 20, 40 veya 60 dk boyunca gerçekleştirildi; Coomassie Blue boyama (üst) ve western blotting (alt) sonuçları gösterilmiştir. Western blotting, ICP4, UL42 veya GAPDH'ye özgü antikorlar ile gerçekleştirildi. Elüat örneği Adım 1.5.5'ten, lizat ise Adım 1.3.6'dan alındı. Ok streptavidini, L ise protein merdivenini göstermektedir.

Şekil 2: Proteomik verilerin sunulmasına yönelik farklı yöntem örnekleri. (A) Pasta grafikleri, 6 hpi'da saflaştırılan viral genomlarla ilişkili protein elüatlarının kütle spektrometrisi ile tanımlanan proteinlerini özetlemektedir. Değerler, her bir fonksiyonel kategori için tanımlanan protein sayısını belirtir. T, tanımlanan toplam protein sayısını gösterir. Renkler şu kategorileri belirtmektedir: mor - RNA işleme, kırmızı - transkripsiyon, yeşil - kromatin yeniden modelleme, turuncu - DNA replikasyonu, sarı - nükleer transport, turkuaz - sitoskelet, koyu mavi - HSV yapısal proteinleri ve gri - diğer/bilinmeyen. (B) Venn diyagramları, 6, 8 veya 12 hpi'da viral genomlarla ilişkili olduğu belirlenen proteinlerin örtüşmelerini göstermektedir. (C) Bir STRING haritası, 5 dakikalık bir EdC pulse sonrası viral replikasyon çatallarında zenginleşen proteinleri göstermektedir. Etiketlenmemiş negatif kontrole kıyasla 5 kat zenginleşen insan proteinleri, yalnızca yüksek güvenilirlikli etkileşimleri görüntüleyecek veri ayarlarıyla STRING kullanılarak oluşturulan fonksiyonel etkileşim haritasında gösterilmiştir. Etkileşimleri haritalamak için gen isimleri kullanılmıştır. Daireler, aynı biyolojik süreçte görev yapan proteinleri belirtir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
MRC-5 hücreleri	ATCC	CCL-171
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	26140-179
Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı (DMEM)	Gibco	12800-082	%10 FBS, 2 mM L-glutamin, 12 mM (flasklarda büyütme için) veya 30 mM (kaplarda büyütme için) sodyum bikarbonat ile tamamlanmış
60 cm² doku kültürü kabı	Thermo Fisher Scientific	166508
Tris Tamponlu Salin (TBS), pH 7,4			137 mM NaCl, 5 mM KCl, 491 mM MgCl, 680 mM CaCl, 25,1 mM Trisin
HSV-1 stoğu			1x10'dan daha yüksek titreli stoklar⁹ PFU/mL değerleri en iyi sonucu verir
Sephadex G-25 kolonu (PD-10 Tuz Giderme Kolonu)	GE Healthcare	17085101
Dimetil sülfoksit (DMSO)	Fisher Scientific	D128-1
5´-Etinil-2´-deoksisitidin (EdC)	Sigma-Aldrich	T51307	40 mM stok hazırlamak için DMSO içinde çözün, alikotlayın ve -'de saklayın20 °C
2´-deoksisitidin (deoksiC)	Sigma-Aldrich	D3897	40 mM stok hazırlamak için suda çözün, aliquotlara ayırın ve -'de saklayın20 °C
Nükleer Ekstraksiyon Tamponu (NEB)			Taze (20 mM Hepes pH 7,2, 50 mM NaCl, 3 mM MgCl2₂, 300 mM Sukroz, %0,5 Igepal)
Hücre kazıyıcı	Bellco cam malzemeler	7731-22000	Kullanmadan önce otoklavlayın
Tripan mavisi çözeltisi	Sigma-Aldrich	T8154
PBS, pH 7,2 (10x)			1,37 M NaCl, 27 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄, 18 mM KH₂PO₄ (kullanmadan önce steril su ile 1x'e seyreltin)
Bakır (II) sülfat pentahidrat (CuSO₄·5H₂O)	Fisher Scientific	C489	10 mM stok hazırlayın ve şu koşullarda saklayın: 4 °C 1 aya kadar
(+) Sodyum L-askorbat	Sigma-Aldrich	A4034	10 mM'lık stok çözeltiyi taze olarak hazırlayın ve kullanıma kadar buz üzerinde saklayın
Biyotin azit	Invitrogen	B10184	DMSO içinde 10 mM stok hazırlayın, alikotlayın ve -'de saklayın20 °C 1 yıla kadar
Klik Reaksiyon Karışımı			Belirtilen sırayla reaktifler eklenerek kullanımdan hemen önce hazırlayın (10 mL: 8,8 mL 1x PBS, 20 mL 10 mM CuSO4)₄, 25 mL 10 mM Biyotin Azid, 1 mL 10 mM sodyum askorbat)
Tam Proteaz İnhibitör Kokteyli	Roche	11697498001	50x stok hazırlamak için 1 mL suda çözün, şu koşullarda saklanabilir: 4 °C 1 haftaya kadar veya doğrudan 50 mL tampona 1 tablet ekleyerek
Dondurma tamponu			Taze hazırlayın (7 mL %10 gliserol, 3 mL NEB, 200 μL 50x proteaz inhibitörü)
Tampon B1			Taze hazırlayın (25 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, %1 Igepal, 1x proteaz inhibitörü)
Tampon B2			Taze (150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, %0,5 Igepal, 1x proteaz inhibitörü) hazırlayın
Tampon B3			Taze (150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 1x proteaz inhibitörü) hazırlayın
3 mm mikro uçlu prob ile donatılmış Vibra Cell Ultra Sonic Processer	Sonikasyon	VCX 130
Hücre süzgeci	Falcon	352360
Dynabeads MyOne Streptavidin T1	Life Technologies	65601
DynaMag-2 Mıknatısı	Life Technologies	12321D
Mini Tüp Rotatörü	Fisher Scientific	260750F
2x Laemmli örnek tamponu			40 mg SDS, 2 mL %10 gliserol, 1,25 mL 1 M Tris (pH 6,8) ve 10 mg bromofenol mavisini 8 mL su içerisinde karıştırın. Şurada saklayın: 4 °C 6 aya kadar saklanabilir. Kullanmadan önce, 1 M DTT ekleyerek nihai konsantrasyonu 20 mM'ye getirin.
1,5 mL tüp için kapak kilitleri	Fisher Scientific	NC9679153
Standart western blotting reaktifleri
NOVEX Kolloidal Blue Boyama Kiti	Invitrogen	LC6025
12 kuyucuklu doku kültürü plağı	Corning	3513
Lamel	Fisher Scientific	12-545-100	Kullanmadan önce otoklavlayın
Mikroskop lamları	Fisher Scientific	12-552-5
%16 paraformaldehit	Elektron Mikroskobu Bilimleri	15710	Kullanmadan önce 1x PBS ile %3,7'ye seyreltin
Sığır serum albümini (BSA)	Fisher Scientific	BP1605	1x PBS içinde %3'lük hazırlayın
Permeabilizasyon tamponu (%0,5 Triton-X 10)	Sigma-Aldrich	T8787	1x PBS içerisinde %0,5'lik Triton-X 10 hazırlayın
Klik reaksiyon kokteyli - Click-iT EdU Alexa Fluor 48 Imaging Kit	Molecular Probes	C10337	Üretici protokolüne göre hazırlayın
2x SDS-bikarbonat çözeltisi			%2 SDS, 20 mM NaHCO3₃
10x Tris EDTA (TE), pH 8.0			10 mM Tris, 10 mM EDTA (kullanmadan önce 1x'e seyreltin)
1,5 mL tüpler için mikrocentrifüj
15 ve 50 mL tüpler için masaüstü santrifüj
Hücre kültürü inkübatörü
Biyogüvenlik kabini
Isıtma blokları			65 °C ve 95 °C