Kateterle İlişkili İdrar Yolu Enfeksiyonunu Modellemek için 3D Baskılı Silikon Kaplı Bir Cihaz

Özet

Kaynak:
Ocean E. Clarke¹, Romy A. Dop¹, Tom Hasell¹, Joanne L. Fothergill¹, Daniel R. Neill<sup>2

1</sup>Liverpool Üniversitesi, ² Dundee Üniversitesi

Bu video, kateterle ilişkili idrar yolu enfeksiyonunu simüle etmek için idrar sondalarının iç yüzeyini taklit eden 3D baskılı, silikon kaplı bir cihazın kullanımını göstermektedir.

Protokol

Numune toplamayı içeren tüm prosedürler, enstitünün IRB yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.

1. Flexipeg modellerinin eklemeli imalatı

1. Stereolitografi (100 μm katman yüksekliği) kullanarak mandalları (mandal kapağı başına 24 mandal gereklidir) ve mandal kapaklarını yüksek sıcaklıkta stabil reçineye yazdırın.
   NOT: Mandallar için yüksek sıcaklığa dayanıklı reçine kullanılır ve mandal kapakları denemeden önce otoklavla sterilize edilebilir.
2. %60 dolgulu kaynaşmış biriktirme modelleme (FDM) kullanarak hem kalıp bileşenlerini hem de test tüpü rafının parçalarını 3D olarak yazdırın.
   NOT: Kalıplar ve test tüpü rafları etanolle sterilize edilebildiğinden ve yüksek sıcaklıklarda stabilite gerektirmediğinden, herhangi bir dayanıklı reçine FDM için uygundur.
3. Model bileşenlerinin doğru şekilde yazdırıldığından emin olun ve %70 etanol kullanarak yazdırma işlemindeki fazla kalıntıları temizleyin.
4. Silikon mat kalıbını Şekil 1'de gösterildiği gibi, gerekirse yanlarını bantla yerinde tutarak monte edin.

2. Flexipeg model hazırlama

1. Silikon mat hazırlama
   1. 18 g silikon bazı (katalizör polidimetilsiloksan (PDMS) için 10:1 baz, yoğuşma kürü) bir behere tartın ve iyice birleşene kadar 2 g katalizör ile hafifçe karıştırın.
      NOT: Kalıp içinde kabarcık oluşmasını önlemek için silikon karışımını aşırı çalkalamaktan kaçının.
   2. Birleştirilmiş silikon karışımını FDM baskılı kalıba dökün ve kalıbın yanlarındaki ve üstündeki fazla silikon karışımını silin. Oda sıcaklığında (RT) gece boyunca (en az 18 saat) kürlenmeye bırakın.
   3. Matı kalıptan çıkarın ve yanlardaki fazla silikonu kesin. Paspasın Şekil 1'de gösterildiği gibi dübel kapağına oturduğundan emin olun.
2. Mandal kaplama
   1. Mandalları bir silikon matın içine yerleştirin (mat başına 24 mandal) ve matı bant kullanarak mandal kapağına veya mata benzer boyutlarda plastik bir tepsiye sabitleyin.
   2. 27 g silikon tabanı sığ bir plastik tepsiye (yaklaşık olarak 96 oyuklu bir plaka ile aynı boyutlarda) tartın ve iyice birleşene kadar 3 g katalizör ile iyice karıştırın.
   3. Mandal kapaklarını, mandallar aşağı bakacak şekilde ters çevirin ve mandalları hemen silikon karışımına batırın. Mandal kapağını ters çevirin ve fazla silikonun mandallardan aşağı damlamasına ve mandalların gece boyunca oda sıcaklığında kurumasına izin verin.
      NOT: Hızlı kürlenen silikon (6-8 saat tam kürlenme; 40-60 dakika çalışma süresi) kürlenmeden önce damlamaya/akmaya devam edecektir; bu nedenle, daldırma sırasında tüm mandalın PDMS ile kaplanması zorunlu değildir, çünkü herhangi bir fazlalık kürleme sırasında mandalın geri kalanını kaplayacaktır.
   4. İyileştikten sonra 2.2.2 ila 2.2.3 arasındaki adımları tekrarlayın. mandallar PDMS ile üç kez kaplanana kadar. İkinci kaplama adımına geçmeden önce ilk kaplama katmanının tamamen kürlendiğinden emin olun.
      NOT: Son dübel kaplamaları <2 mm kalınlığında olmalı ve görünür kusurlar olmamalıdır. RT'de gece boyunca inkübasyondan sonra silikon yapışkan kalırsa, 24 saat kürlenmesine izin verin ve mandallar dokunulduğunda hala yapışkansa kaplamaları atın.
   5. Steril bir neşter kullanarak, mandalları kaplama düzeneğinden çıkarmak için silikon kaplı mandalların tabanını (mümkün olduğunca tabana yakın) kesin.
      NOT: İstenilen sayıda mandal ve silikon paspas hazırlanana kadar bu işlem tekrarlanmalıdır. Mandal kaplama işleminde kullanılan fazla PDMS, kürlenmeden önce yeni silikon paspaslar dökmek için kullanılabilir.
3. Model kurulumu
   1. Kaplamalı mandalları silikon paspasın içine yerleştirin ve paspası Şekil 1'de gösterildiği gibi mandal kapağına sabitleyin.
   2. Mandalları yerinde tutmak için mandal kapağının/silikon matın (mandal tabanına takılı) alt tarafını otoklavlanabilir bantla kapatın. Peg kapak kurulumunu kapalı bir otoklavlanabilir torbaya yerleştirin ve kullanmadan önce otoklavla sterilize edin.
      NOT: Mandal kapağındaki mandallar, tek bir yönde 96 oyuklu bir plakaya sığacaktır. Mandal kurulumunu bantladıktan sonra, 96 oyuklu yedek bir plakadaki mandalların hizasını kontrol edin ve otoklav bandını doğru kapak yönüne göre etiketleyin.

3. Modellerin aşılanması

1. Bakteri kültürünün hazırlanması
   1. 10 mL Luria-Bertani (LB) suyunda katı ortam üzerinde yetiştirilen bir döngü dolusu bakteri kolonisini süspanse ederek test edilen bakteri izolatlarının gece boyunca kültürlerini hazırlayın. Gece boyunca (18 saat) 37 °C'de çalkalayarak inkübe edin.
      NOT: Flexipeg biyofilm modelinde kullanım için en az üç biyolojik kopya önerilir.
   2. Kültürleri, 1 mL'lik bir fosfat tamponlu salin (PBS) nihai hacminde 0.1'lik bir OD_600nm'ye(plaka seyreltmesini takiben yaklaşık^{10 8} koloni oluşturan birim (CFU)/mL) normalleştirin.
2. Mikroplaka kurulumu ve aşılama
   1. Şekil 135 (96)'deki plaka düzenine uygun olarak 1 oyuklu bir plakada test kuyucuğuna 8 μL havuzlanmış insan idrarı (PHU ) ayırın. Her kuyu bir teknik kopyayı temsil eder (biyolojik kopya başına en az n = 3 teknik kopya gereklidir).
      NOT: Kullanıcı tarafından istenirse PHU yerine yapay idrar ortamı (AUM) kullanılabilir.
   2. Her test kuyucuğunu 15 μL normalize gece kültürü ile aşılayın, bu da 150 μL'lik bir nihai kuyucuk hacmi ile sonuçlanır. İnokulumun CFU/mL'sini doğrulamak için seri seyreltmeler için en az 100 μL normalleştirilmiş gece kültürü ayırın.
   3. 150 μL steril PHA'yı sadece ilgili kuyucuklara ayırarak negatif kontroller hazırlayın.
   4. Mikroplaka kurulumunun ardından, mandalları ilgili kuyucuklara yerleştirin (mandalların otoklav sterilizasyonundan önce belirlendiği gibi) ve mandal kapağının plakanın yüzeyiyle aynı hizada olduğundan emin olun. Mandal kapağını mikroplaka kapağıyla kapatın ve gerekirse otoklav bandıyla yerinde tutun.
   5. Mandal modellerini, buharlaşmayı önlemek için nemli mavi rulo ile kapalı bir plastik küvete/torbaya yerleştirin ve 37 °C'de 24 saat statik olarak inkübe edin.
3. İnokulum doğrulaması
   1. 180 μL PBS'yi 96 oyuklu bir mikroplakanın ilk kolonunun 2-6. sıralarına ayırın ve ayrılmış 100 μL normalize gece kültürünü ilk kuyucuğa ekleyin.
   2. Normalleştirilmiş gece kültürünün 20 μL'sini birinci kuyucuktan çıkarın ve ikinci kuyuya ayırın, karıştırmak için hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyin.
   3. İlk aşı son kuyucuğa (1 × 10⁵) seyreltilene kadar 3.3.2 adımını tekrarlayın.
   4. Her seyreltmenin 10 μL'lik noktalarını üç kopya halinde uygun katı ortam üzerine yerleştirin. Gece boyunca 37 °C'de statik olarak inkübe edin.
   5. İnkübasyonun ardından, aşının gerçek CFU/mL'sini hesaplamak için her noktadaki koloni sayısını sayın.

4. Biyofilm ölçümü

1. Peg işleme
   1. İnkübasyonun ardından, dübel modelini mikroplakadan çıkarın ve bir alev altında veya bir mikrobiyal güvenlik kabini içinde ters çevirin (mandallar yukarı bakacak şekilde). Mikroplakaları atın.
   2. Yapışmamış hücreleri çıkarmak için mandal kapağını 180 μL steril PBS alikotları içeren yeni bir mikroplakaya aktarın. Toplam üç yıkama adımı için taze PBS'de iki kez tekrarlayın.
      NOT: Yüzeyle ilişkili biyofilmlerin zarar görmesini önlemek için, her bir mikroplakadan dübel kapağını çıkarırken (yani kuyu kenarlarına dokunurken) mandalları bozmaktan kaçının.
2. CFU/mL numaralandırması (biyofilm ilişkili)
   1. Bir alev altında veya bir mikrobiyolojik güvenlik kabininde aseptik olarak çalışarak, tüp rafını (adım 1.2'de üretilmiştir.) Şekil 1'de gösterildiği gibi steril cam test tüpleri ile kurun ve mandal kapağına uyan raf üstünü takın.
   2. Aseptik olarak, her test tüpüne 600 μL steril PBS ayırın.
   3. Mandal kapağını, mandallar raftaki tüplerle aynı hizada olacak şekilde rafa yerleştirin. Mandal kapağındaki otoklav bantlarını çıkarın.
   4. Steril forseps kullanarak, mandalları dübel kapağından ve aşağıda hizalanmış ilgili test tüplerine itin.
   5. Tüp kapaklarını değiştirin ve biyofilmle ilişkili hücreleri peg yüzeyinden ayırmak için her tüpü 60 saniye vorteksleyin.
   6. Her tüpten 100 μL çıkarın ve steril PBS'de daha önce adım 3.3'te açıklandığı gibi seri seyreltin.
   7. Serolojik bir pipet plakası kullanarak, uygun katı ortam üzerinde her seyreltmenin 10 μL'lik noktalarını kullanın ve gece boyunca 37 °C'de statik olarak inkübe edin.
   8. İnkübasyonun ardından, her seyreltme plakasındaki koloni sayısını sayın ve CFU/mL'yi hesaplamak için kullanın.
3. Kristal menekşe boyama
   1. 96 oyuklu bir mikroplakanın 24 test kuyucuğuna 180 μL %0,1 (a/h) kristal menekşe (steril suda) ekleyin.
   2. Durulanmış dübel modelini (mandallar ve dübel kapağı) mikroplakanın karşılık gelen kuyucuklarına yerleştirin. Oda sıcaklığında 20 dakika statik olarak inkübe edin.
   3. İnkübasyonun ardından, peg modelini mikroplakadan çıkarın ve mikroplakayı atın.
   4. Uygun büyüklükte bir küvette, hafifçe çalkalarken tüm mandalı musluk suyunda durulayın. Üç kez tekrarlayın.
   5. Mandal modelini ters çevirin ve mandalların RT'de tamamen kurumasını bekleyin.
   6. 180 μL %30 asetik asidi 96 oyuklu taze bir mikroplakaya ekleyin ve kurutulmuş mandal modelini ilgili kuyucuklara yerleştirin. RT'de 30 dakika inkübe edin.
   7. Mandal modelini mikroplakadan çıkarın ve bir mikroplaka okuyucu veya spektrofotometre kullanarak lekeli kuyucukların OD_540nm'sini okuyun.
   8. Mandallarda biyofilm oluşumunu hesaplamak için, lekeli negatif kontrol mandallarının OD_540nm'sinin ortalamasını alın ve test edilen mandalların ortalamasından çıkarın.

Sonuçlar

Şekil 1: Flexipeg model kurulumunun şematik gösterimi. (1) Biyofilm oluşumu için idrar sondası yüzeyini kopyalamak üzere polidimetilsiloksan (PDMS) ile kaplanmış tek bir Flexipeg. (2) (3) tek tek mandalları yerinde tutan silikon mat ve (4) 9...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
96 kuyucuklu Mikroplakalar	Greiner	650161	U şeklinde/yuvarlak alt.
Asetik asit	SLS	695092-2.5LSIG	≥ %99,7 ACS reaktifi.
Kristal menekşe	Merck	61135-25G
Bireysel mandal	House	Flexipeg bileşenleri 3D olarak basılacak	Yüksek sıcaklığa dayanıklı reçine kullanılarak eklemeli üretim (Flexipeg modeli başına 24 mandal gereklidir). Protolabs (NL) tarafından Formlabs yüksek sıcaklık reçinesi kullanılarak üretilmiştir.
Luria-Bertani (LB) suyu	Neojen	NCM0088B	LB et suyu (Miller).
96 oyuklu bir plakaya uyan kapak	House	Flexipeg bileşenleri 3D olarak basılacak	Yüksek sıcaklığa dayanıklı reçine kullanılarak eklemeli üretim.
Silikon mat hazırlamak için kalıp	House	Flexipeg bileşenleri 3D olarak basılacak	Herhangi bir dayanıklı malzemeden eklemeli üretim. Protolabs (NL) tarafından ABS prototipleme reçinesi kullanılarak üretilmiştir.
Silikon mat tarafını hazırlamak için kalıp	House	Flexipeg bileşenleri 3D olarak basılacak	Herhangi bir dayanıklı malzemeden eklemeli üretim.
Fosfat tamponlu salin	Merck	P4417-50SEKME
Havuzlanmış insan idrarı	-	-	Merkez üniversite araştırma etik kurulu tarafından etik onay alındıktan sonra sağlıklı donörlerden toplanmıştır.
Cam tüpler için raf	House	Flexipeg bileşenleri 3D olarak basılacak	Herhangi bir dayanıklı malzemeden eklemeli üretim.
Silikon (PDMS)	MB Fiberglas	GP3481-F	Polycraft Genel Amaçlı RTV Yoğuşma Kürü Kalıp Yapımı Silikon Kauçuk.
Mandal kapağına uyan üst kısım	House	Flexipeg bileşenleri 3D olarak basılacak	Yüksek sıcaklığa dayanıklı reçine kullanılarak eklemeli üretim.
Foley kateterler	Büyük Ayı Sağlık İngiltere Ltd.		14 kanal, %100 silikon