Genom İçeren Adenoviral Vektörlerin Sezyum Klorür Bazlı Saflaştırılması

Bu makalede

Özet

Kaynak: Ehrke-Schulz, E., et al. Cloning and Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors Based on the Human Adenovirus Type 5. J. Vis. Exp. (2016)

Bu video, gen aktarımı, vektör karakterizasyonu ve preklinik terapötik çalışmalar uygulamaları için genom içeren viryonların ayrıştırılmasını sağlayan sezyum klorür gradyanlı ultrasentrifüjasyon kullanılarak yüksek kapasiteli adenoviral vektörlerin saflaştırılmasını göstermektedir

Protokol

HCAdV (Yüksek kapasiteli adenoviral vektörler) Saflaştırılması ve Diyalizi
1. Sezyum klorür (CsCl) gradyanları için viral lizat hazırlamak üzere, hücre-virüs süspansiyonunu sıvı azot ile dondurun ve 37 °C'deki bir su banyosunda 4 kez çözdürün.
2. Viral lizatı oda sıcaklığında (RT) 50 x g'de 8 dk santrifüjleyin ve HCAdV (yüksek kapasiteli adenoviral vektörler) içeren süpernatantı toplayın.
3. Ultrasantrifüjasyon için CsCl çözeltilerini şu şekilde hazırlayın. Sırasıyla 37,5 g (1,5 g/cm³ için), 3,5 g (1,35 g/cm³ için) ve 31,25 g (1,25 g/cm³ için) CsCl tozu tartın ve dH₂O ile 25 ml'ye tamamlayın.
  1. Çözelti berraklaşana kadar karıştırın ve çözeltileri steril filtreleyin. Son olarak, her çözeltiden 1 ml alın ve yoğunluğun doğru olup olmadığını kontrol etmek için hassas terazide tartın. 1 ml sırasıyla 1,5 g, 1,35 g ve 1,25 g gelmelidir.
  2. Yoğunluk çok yüksekse, küçük hacimlerde (µl) steril dH₂O'yu kademeli olarak ekleyerek ayarlayın. dH₂O eklemesinden sonra yoğunluğu tekrar ölçün. Gerektiğinde daha fazla dH₂O ekleyin.
  3. Yoğunluk doğru olana kadar işlemi tekrarlayın. Yoğunluk çok düşükse, az miktarda CsCl tozu ekleyerek ayarlayın. Tekrar steril filtreleyin ve yoğunluğu kontrol edin. Yoğunluk çok yüksekse, daha önce tarif edildiği gibi dH₂O ekleyerek ayarlayın. Yoğunluk hala çok düşükse daha fazla CsCl ekleyin, tekrar steril filtreleyin ve yoğunluğu kontrol edin. Yoğunluk doğru olana kadar işlemi tekrarlayın.
4. 6 şeffaf ultrasantrifüj tüpünde CsCl basamak gradyanları hazırlayın. CsCl çözeltilerini şu sırayla tüplere dikkatlice ve yavaşça pipetleyin: 0,5 ml 1,5 g/cm³ CsCl çözeltisi, 3 ml 1,35 g/cm³ CsCl çözeltisi ve 3,5 ml 1,25 g/cm³ CsCl çözeltisi (Şekil 1C).
5. Adım 1.2'den elde edilen berraklaştırılmış vektör süpernatantından yaklaşık 4,5 ml'yi 1,25 g/cm³ CsCl tabakasının üzerine ekleyin. HCAdV genomu içeren viral partikülleri boş partiküllerden ve hücre kalıntılarından ayırmak için gradyanları bir ultrasantrifüjde, salınım rotoru (SW-41) kullanarak 12 °C'de, en az 2 sa boyunca 26.0 x g (35.0 rpm) hızda, yavaş hızlanma ve yavaşlama ile santrifüjleyin.
  NOT: Optimal koşullar altında, tüplerin üst kısmında hücre kalıntılarından oluşan yaygın bir bant oluşur. Altında iki beyaz bant gözlemlenebilir. Üst bant boş partikülleri içerirken, alt bant HCAdV'ye karşılık gelir (Şekil 1C ve 2A).
6. Hücre kalıntısı ve boş partikül tabakalarını dikkatlice uzaklaştırın; her tüpün alt bantlarından 1 ml toplayın ve virüsü temiz bir pipet ucuyla steril 50 ml'lik bir tüpe aktarın. Toplanan virüs partiküllerine 24 ml'ye kadar 1,35 g/cm³ CsCl çözeltisi ekleyin ve dikkatlice karıştırın.
7. Santrifüj tüplerini 1,35 g/cm³CsCl-virüs çözeltisiyle ağzına kadar doldurun ve bir ultrasantrifüjde, salınım rotoru (SW-41) kullanarak yavaş hızlanma ve yavaşlama ile 12 °C'de 26.0 x g (35.0 rpm) hızda gece boyunca (O/N) (18-20 sa) santrifüjleyin.
8. Belirgin alt bantta bulunan HCAdV'yi toplayın. Olası üst bant boş partikülleri içerdiğinden, üst tabakaları bir pipet kullanarak üstten uzaklaştırın (bkz. Şekil 1C ve 2B). Ardından, alt bandı pipetle alın.
9. Tampon değişimi için toplanan virüs partiküllerini diyalize edin.
  1. Yaklaşık 8 cm uzunluğunda bir diyaliz tüpü şeridi kesin (MWCO: 50.0), 3 kez steril dH₂O ile yıkayın. Ardından, diyaliz tüpünün bir ucunu plastik bir klemple kapatın ve adım 5.8'de toplanan virüsü 1 ml'lik bir pipet kullanarak tüpe aktarın. Tüp içinde hava kabarcığı kalmamasına dikkat edin ve diğer ucu plastik bir klempli diyaliz kapatıcısı ile kapatın.
  2. 1 L diyaliz tamponunda (iyonlaşmamış H₂O içinde 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), %10 gliserol ve 1 mM MgCl₂ (magnezyum klorür)) 4 °C'de, yavaş karıştırma ile 2 sa diyaliz yapın. Diyaliz tamponunu 2 L taze diyaliz tamponu ile değiştirin ve 4 °C'de, yavaş karıştırma ile gece boyunca (O/N) diyalize edin. Alternatif olarak, bir sükroz tamponu kullanın (140 mM NaCl (sodyum klorür), 5 mM Na₂HPO₄.2H₂O (disodyum hidrojen fosfat), 1,5 mM KH₂PO₄ (potasyum dihidrojen fosfat) ve 730 mM sükroz, pH 7,8).
  3. Adım 1.9.2'deki diyalize edilmiş virüs partiküllerini 1 ml'lik bir pipetle toplayın. İstenilen küçük hacimlerde (25-10 µl) birden fazla alikot hazırlayın ve saflaştırılmış virüsü -80 °C'de saklayın.

Sonuçlar

Şekil 1. Klonlama prosedürü ve HCAdV (Yüksek kapasiteli adenoviral vektörler) genomunun pAdVFTC'den salınımına yönelik temsilci sonuçlar. (A) İlgilen gen (GOI)-ekspresyon kasetinin pHM5'ten PI-SceI ve I-CeuI sindirimi ile salınımı. (B) Sırasıyla saflaştırılmış GOI-ekspresyon kaseti ve PI-SceI ve I-CeuI ile sindirilmiş, saflaştırılmış, defosforile pAdVFTC. (C) GOI içeren ve içermeyen pAdVFTC klonlarının analitik HincII sindirimi. (D) GOI taşıyan HCAdV-genomunun pAdVFTC-GOI'den NotI sindirimi ile salınımı

Şekil 2. Sezyum klorür (CsCl) gradyan santrifüjasyonu sonrası temsili sonuçlar. (A) Basamaklı gradyan uygulandıktan sonra (bkz. adım 1.5); (B) Sürekli gradyan uygulandıktan sonra (bkz. adım 1.7).

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Ultra Clear ultrasantrifüj tüpleri	Beckmann Coulter	344059	yoğunluk gradyanı santrifügasyonu
Ultrasantrifüj	Beckmann Coulter		yoğunluk gradyanı santrifügasyonu
SW-41 rotor	Beckmann Coulter		yoğunluk gradyanı santrifügasyonu
Spectrum Laboratories Spectrapor Membran	VWR	132129	diyaliz tüpü
Kullanıma hazır diyaliz kasetleri	Thermo	66383	diyaliz
Sizyum klorür	Carl Roth	8627.1	yoğunluk gradyanı santrifügasyonu
LB besiyeri	Carl Roth	X968.3	bakteriyel büyüme besiyeri
Tris-HCl %9	Carl Roth	9090.3	diyaliz tamponu/ lizis tamponu
Gliserol %9.5	Carl Roth	3783.1	diyaliz tamponu
MgCl₂ %98.5	Carl Roth	KK36.2	diyaliz tamponu
NaCl	Carl Roth	3957.1	isteğe bağlı diyaliz tamponu
KH₂PO₄	Carl Roth	3904.2	isteğe bağlı diyaliz tamponu
Sükroz	Carl Roth	9286.1	isteğe bağlı diyaliz tamponu
Na₂HPO₄·2H₂O	Carl Roth	4984.2	isteğe bağlı diyaliz tamponu
1.5 ml tüpler	sarstedt	72,730,05	virüs preparasyonlarının -80 °C'de saklanması