Video, bir fare modelinde rekombinant viral vektörün ultrason eşliğinde intramiyokardiyal enjeksiyonu için bir yöntemi göstermektedir. Bu teknik, transgen ekspresyonunun kalp fonksiyonu üzerindeki etkilerini incelemek amacıyla kalbe hedeflenmiş gen iletimi sağlar.
Yöntem makalesi
Gen Etkilerinin Kalp Fonksiyonu Üzerindeki Değerlendirmesi İçin Fare Kalbine Viral Gen Aktarımı
70 görüntülenme
⸱
31 Ağustos 2026
Bu makalede
Özet
Protokol
1. Kemirgen ventriküler dokularda viral transgen ekspresyonu
NOT: Hedef geni eksprese eden rekombinant adenovirüsü veya adeno-ilişkili virüsü (AAV) ve Ad-GFP (Yeşil floresan protein) (titresi 1 x 1010 plak oluşturan birim [PFU]/mL) veya AAV9-GFP (titresi 1 x 1013 genom kopyası [GC]/mL) gibi ilgili kontrol virüsünü (bakınız Malzeme Tablosu), −80 °C dondurucuda saklayın.
- Virüs enjeksiyonu gününde, virüsü buz üzerinde çözün. Hedef geni eksprese eden virüsü ve kontrol virüsünü, 30 G ½ iğneli iki ayrı şırıngaya (hacim = 50 µL) çekin ve kullanıma kadar buz üzerinde tutun.
NOT: Şırınga ve iğnedeki tüm hava kabarcıkları dikkatlice temizlenmelidir. - Sıçanlara veya farelere buprenorfin uygulayın (sıçanlar için 0.05 mg/kg, fareler için 0.1 mg/kg, subkutan); bir saat sonra %3 isofluran kullanarak anestezi indükleyin ve sonraki işlem için isofluranı %2'de (0.5-1.0 L/dk akış hızında %100 oksijen içinde) tutun.
- Hayvanın vücudunu (örneğin kuyruğunu) bir pens yardımıyla nazikçe sıkın; hayvan sıkmaya herhangi bir vücut hareketiyle yanıt vermiyorsa, uygun anestezi sağlandığı onaylanmış olur.
- Elektrikli bir ısıtma pedi kullanarak vücut sıcaklığını 37 °C'de tutun. Göğüs bölgesindeki tüyleri bir tüy tıraş makinesi kullanarak tıraş edin.
NOT: Potansiyel olarak düzensiz ısı dağılımı nedeniyle elektrikli ısıtma pedi kullanılırken dikkatli olunmalıdır. - Korneanın kurumasını önlemek için her iki göze oftalmik pomad uygulayın.
- Hayvanı sırtüstü pozisyonda tutun ve hayvanın kalbinin kısa eksen yönünde ultrason görüntülemesi için bir preklinik görüntüleme sistemi (bakınız Malzemeler Tablosu) kullanın.
NOT: Sonraki adımlar, steril bir ortam sağlayan seviye II biyogüvenlik kabininde gerçekleştirilir. Güvenli iğne kullanımı da dahil olmak üzere standart güvenlik prosedürleri uygulanır. - Hayvanın sol alt göğüs bölgesini, iyot bazlı veya klorheksidin bazlı bir solüsyon ile alkolü sırayla üç kez dairesel hareketlerle sterilize edin.
- Ultrason görüntüleme kılavuzluğunda, 1.1. adımda hazırlandığı gibi virüs içeren şırınganın 30 G 1/2 iğnesini, vücudun sol alt göğüs yanından hayvanın göğsüne yerleştirin.
- İğne ucunu sol ventrikül ön serbest duvarına yaklaştırın ve yavaşça 10-15 μL virüs enjekte edin. Başarılı enjeksiyonu, ultrason görüntülerinde iğne ucuna yakın bölgedeki artan parlaklıktan doğrulayın.
NOT: Miyokard dokularındaki fiziksel hasarı önlemek için her bölgeye enjekte edilen virüs miktarı 15 μL'den fazla olmamalıdır. - İğneyi kalpten geri çekin ve aynı miktarda virüsün ikinci ve üçüncü enjeksiyonları için sol ventrikülün diğer bölgelerine yerleştirin.
NOT: Toplam enjeksiyon bölgesi sayısı deneysel tasarımla belirlenir. Fokal transgen ekspresyonu gerekiyorsa tek bir enjeksiyon yeterlidir; daha difüz bir transgen ekspresyonu gerekiyorsa genellikle birden fazla enjeksiyon bölgesi (üç ila beş) gereklidir. - Enjeksiyonlar tamamlandıktan sonra hayvanı kafesine geri koyun.
- Hayvan, sternal rekumbansı sürdürecek kadar yeterli bilinci geri kazanana kadar dikkatle izleyin ve ardından barınma odasına geri götürün.
- Takip eden 2 gün boyunca hayvana buprenorfin hidroklorür uygulayın (fareler için günde iki kez 0.1 mg/kg, sıçanlar için günde iki kez 0.05 mg/kg, subkutan). Hayvanları vivaryuma geri götürün ve olağandışı ağrı veya sıkıntı belirtileri için günlük olarak izleyin; böyle bir durum tespit edilirse, hayvanları Kurumsal Hayvan Bakım Komitesi protokollerine göre tedavi edin.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 30 G ½ PrecisionGlide İğne | Becton Dickinson (BD) | 305106 | |
| Adeno-ilişkili virüs (Yeşil floresan protein(GFP) eksprese eden AAV9) | Vector Biolabs | 7007 | |
| Adenovirüs (Ad-GFP) | Vector Biolabs | 1060 | |
| Biyogüvenlik kabini (Seviye II) | Microzone Corporation | N/A | Model #: BK-2-4 |
| Buprenorfin | Vetergesic | DIN 02342510 | |
| Tüy tıraş makinesi | WAHL Clipper Corporation | 78001 | |
| Hamilton şırıngası | Sigma-Aldrich | 20701 | 705 LT, hacim 50 μL |
| Isıtma pedi | Life Brand | E12107 | |
| İzofluran | Fresenius Kabi Ltd. | M60303 | |
| Fareler (Ctnnb1flox/flox) | Jackson Labs | 4152 | |
| Fareler (αMHC-MerCreMer) | Jackson Labs | 5650 | |
| Oftalmik pomad | Systane | DIN 02444062 | |
| Sıçan (Sprague-Dawley, erkek) | Charles River | 400 | |
| Neşter uçları | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| Neşter sapı | Fine Science Tools | 10007-12 | |
| VEVO3100 Preklinik Görüntüleme Sistemi | VisualSonic Inc. | N/A |
