İmmünohistokimyasal Boyama Kullanılarak Resellülerize Sıçan Karaciğerinde Viral Transdüksiyonun Doğrulanması

Özet

Kaynak: Hiller, T. et. al. Study of Viral Vectors in a Three-dimensional Liver Model Repopulated with the Human Hepatocellular Carcinoma Cell Line HepG2. J. Vis. Exp. (2016)

Bu video, reselülerize edilmiş bir sıçan karaciğer modelinde viral gen transferini değerlendirmek için yapılan immünohistokimyasal boyamayı göstermektedir. Antikor tespiti ve nükleer boyama ile ko-lokalizasyonuyla doğrulanan raporlayıcı ekspresyonu, hücrelerdeki başarılı viral transduksiyonu göstermektedir.

Protokol

1. Resellülerize Sıçan Karaciğerinin Transdüksiyonu

1. Adeno-ilişkili virüslerden türetilen viral vektörün (AAV vektörü) büyük ölçekli üretimi
   1. AAV vektörlerinin üretimi, saflaştırılması ve miktar tayini:
      1. Kısaca, AAV vektörlerini roller şişelerde üretin ve iodixanol gradyan santrifüjasyonu ile saflaştırın. Kalıntı iodixanolü PD10 jel filtrasyon kolonları üzerinden filtrasyon yaparak uzaklaştırın. Genomik AAV DNA'yı standart olarak kullanarak kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) ile AAV vektör konsantrasyonunu belirleyin.
         NOT: Bu çalışmada kullanılan self-komplementer, psödotiplenmiş AAV2/6 vektörü, transduksiyon verimliliğini göstermek için bir raporlayıcı olarak emerald yeşil floresan raporlayıcı protein EmGFP ve endojen olarak eksprese edilen bir genin (insan siklofilin B (hCycB), Şekil 1) knockdown'ı için bir kısa saç tokası RNA (shRNA) ekspresyon kaseti kodlamıştır. Serotip 6 psödotiplenmiş scAAV vektörlerinin yeterli miktarda olduğundan emin olun (karaciğer modeli başına 2.7 x 10¹³ AAV vektörü).
2. Karaciğer Modelinin Transduksiyonu
   1. Uygun hacimde fosfat tamponlu salin (PBS) ekleyerek AAV vektör çözeltisini 5 mL'de 2.7 x 10¹³ vektör genomu nihai konsantrasyonuna ayarlayın.
   2. Tüpleri kanülden çıkararak karaciğeri medya devresinden ayırın. Portal venin kanülüne 5 mL'lik bir şırınga bağlayın ve AAV vektör çözeltisinin tamamını (5 mL) enjekte edin.
      NOT: İsteğe bağlı olarak, AAV vektör çözeltisinin karaciğer genelindeki dağılımını izlemek için fenol kırmızısı (5 µg/ml) ekleyin.
   3. Pompalama yapmadan 1 saat inkübe edin. Akış hızını kademeli olarak artırın; 10 dakika boyunca 1.25 ml/min ile başlayın, ardından 20 dakika boyunca 2.5 ml/min ve 30 dakika boyunca 3.75 ml/min uygulayın. Resellülerize edilmiş sıçan karaciğerini 6 gün boyunca kültüre edin.

2. Resellülerize Edilmiş Transdükse Sıçan Karaciğerinin Değerlendirilmesi

1. Hematoksilin ve eozin (HE) boyama ve İmmünohistokimyasal Analiz
   1. Bir skalpel kullanarak her bir karaciğer lobundan örnekler (0.5 x 0.5 x 1.5-2 cm) alın.
   2. Örnekleri %4 paraformaldehit (PFA) + %4 sükroz çözeltisinde 4 °C'de 1,5 saat inkübe edin. (Dikkat: PFA toksik ve kanserojendir. PFA'yı her zaman bir çeker ocak içinde tutun ve uygun koruyucu kıyafetler giyin.) PBS ile üç kez yıkayın (her yıkama adımı için 1 dk) ve %8 sükrozda 4 °C'de gece boyunca inkübe edin.
   3. Fiksasyon ortamını plastik kriyokalıplara dökün ve örnekleri, hava kabarcığı kalmayacak şekilde fiksasyon ortamına yerleştirin. Örnek tamamen örtülene kadar fiksasyon ortamı ekleyin. Gömülmüş örnekleri daha sonraki kullanıma kadar -80 °C'de saklayın.
   4. Bir kriyotom ile kriyokesitler (10 µm) hazırlayın. Resellülarizasyonu hematoksilin + eozin boyama ile değerlendirin. Transdüksiyon verimliliğini, hedef gen için (burada: EmGFP) immünohistokimyasal boyama ile değerlendirin.

Sonuçlar

Şekil 1. Bu çalışmada kullanılan self-komplementer, psödotiplenmiş AAV2/6 vektörünün haritası. Genom, AAV2'nin ters uç tekrarlarından (ITR) oluşur ve CMV promotör kontrolü altında EmGFP'nin yanı sıra U6 promotör kontrolü altında bir shRNA kodlar.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Tissue-Tek O.C.T.	Weckert-Labortechnik	600001
Kriyokalıp 15 x 15 x 5 mm	Sakura	4566
İnkübatör	Fraunhofer	/