Tetrasiklin Duyarlı bir Lentiviral shRNA Ekspresyon Sistemi Kullanarak Koşullu Knockdown Hücrelerin Oluşturulması

Özet

Kaynak: Kubala, M. H. & DeClerck, Y. A. Conditional Knockdown of Gene Expression in Cancer Cell Lines to Study the Recruitment of Monocytes/Macrophages to the Tumor Microenvironment. J. Vis. Exp. (2017)

Bu video, Tet-indüklenebilir lentiviral shRNA sistemi kullanılarak koşullu nakavt (knockdown) kanser hücre hatlarının oluşturulmasını göstermektedir. Viral transduksiyon, antibiyotik seçimi ve doksisiklin ile indüklenen gen susturma adımları ana hatlarıyla açıklanmaktadır.

Protokol

1. Stabil transduce edilmiş hücre hatlarının oluşturulması
   1. HCT116 kolon kanseri hücrelerini ve MDA-MB-231 meme kanseri hücrelerini, %10 fetal bovin serum (FBS) ve %1 penisilin/streptomisin (Pen/Strep) ile takviye edilmiş Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) içerisinde, 12 kuyucuklu bir plakada kuyucuk başına 50.000 hücre olacak şekilde ekleyin. 37 °C'de ve %5 CO2 ortamında inkübe edin. 37 °C %5 CO2'de₂ hücreler %60 - 70 konfluens düzeyine ulaşana kadar.
   2. Hücreleri fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın, kanser hücrelerine 1 mL virüs içeren ortam ekleyin ve gece boyunca şu koşullarda inkübe edin: 37 °C %5 CO2'de₂Kontrol olarak, kanser hücrelerinin bulunduğu 2 kuyucuğa %10 FBS ve %1 Pen/Strep ile desteklenmiş 1 mL taze DMEM besiyeri ekleyin.
   3. Virüs içeren besiyerini aspirasyon yoluyla dikkatlice uzaklaştırın. Hücreleri PBS ile yıkayın ve besiyerini %10 (v/v) tetrasiklin içermeyen (Tet-free) FBS ve %1 Pen/Strep içeren DMEM ile değiştirin.
   4. 72 saat sonra hücreleri PBS ile yıkayın ve besiyerini %10 Tet-free FBS ve %1 Pen/Strep içeren DMEM ile değiştirin, 1 µg/mL virüsle transduksiyon yapılmış hücrelerin seçimi için puromisin.
      1. Kullanılan hücre hattına bağlı olarak, farklı puromisin konsantrasyonlarını (0,1, 0,5, 1, 2 ve 5 µg/mLtransdükse edilmemiş hücrelerde bir dizi puromisin konsantrasyonunu (0,1, 0,5, 1, 2 ve 5 µg/mL) test ederek ve 3 günlük kültür sonunda hiçbir kontrol hücresinin hayatta kalmadığı en düşük konsantrasyonu seçerek, kullanılan hücre hattına göre optimal seleksiyon için puromisin konsantrasyonunu ayarlayın.
   5. Hücreleri 3 - 14 gün boyunca puromisin varlığında kültüre ederek virüsle transduksiyon yapılmış hücreleri seçin. Kontrol olarak, transduksiyon yapılmamış hücrelerin bulunduğu iki ek kuyucuk hazırlayın; bunlardan birine puromisin içeren besiyeri, diğerine ise puromisin içermeyen besiyeri ekleyin. Virüsle transduksiyon yapılmış hücrelerin bulunduğu kuyucukta, kontrol kuyucuklarına kıyasla puromisinin hücreler üzerinde kısmi öldürücü etkisini gözlemleyin.
      NOT: Transdükse edilmemiş hücreler, puromisin varlığında büyümezler.
   6. Puromisin dirençli HCT116 kolon kanseri ve MDA-MB-231 meme kanseri hücrelerinde koşullu knockdown (KD) verimliliğini doğrulayın.
      NOT: Doksisiklinin etkili konsantrasyonu kullanılan hücre hattına göre değişiklik gösterecektir ve titrasyonu yapılmalıdır (tipik olarak 100 ng/mL ile 2 µg/mL).
      1. Hücreler için toksik olmayan ancak ilgilenilen proteinin ekspresyonunu aşağı düzenlemede etkili olan doksisiklin konsantrasyonunu belirleyin. Bu protokolde, 1 µg/mL in vitro ortamda başarıyla kullanılmıştır.
      2. Hücreleri 0,1, 1 ve 2 µg/mL doksisiklin varlığında ve yokluğunda 72 saat boyunca kültüre edin. 2 µg/mL doksisiklin. Ekspresyonu azaltılmış proteinin (burada, plazminojen aktivatör inhibitörü 1 (PAI-1)) hücre lizatındaki ekspresyon seviyesini Western blot analizi ile doğrulayın. Koşullu olarak kısa saç tokası RNA (shRNA) eksprese eden HCT116 ve MDA-MB-231 hücrelerini, scrambled kontrol hücreleri ile karşılaştırın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Tet-pLKO-puro lentiviral vektör	Addgene	21915
FBS (Tetrasiklin içermeyen)	Omega Scientific	FB-15
psPAX vektörü	Addgene	12260
pMD2.G vektörü	Addgene	12259
HEK293 hücreleri	ATCC	CRL-1573
PBS	Corning	21-031-CV
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)	Corning	10-013-CV
Fosfat tamponlu salin (PBS)	Corning	21-031-CV
4-(2-hidroksietil)-1-piperazinetansülfonik asit (HEPES)	Sigma-Aldrich	H3375
Puromisin	Sigma-Aldrich	P9620
Doksisiklin hiklat	Sigma-Aldrich	D9891-25g
Roswell Park Memorial Institute (RPMI)	Corning	10-040-CV
Penisilin-Streptomisin	Gibco	15140122