Kademeli Sakkaroz Santrifüjasyonu Kullanarak Virüsle Zenginleştirilmiş Süspansiyon Hazırlanması

Özet

Kaynak: Vijayraghavan, S. and Kantor, B. A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells. J. Vis. Exp., (2017)

Bu video, hücre kültürü süpernatantındaki viral partikülleri saflaştırmak ve konsantre etmek için sakroz gradyanları ve yastıkları kullanan iki adımlı bir ultrasantrifüj yöntemini göstermektedir. Bu prosedür, yüzer yoğunluğa dayalı ayırımı mümkün kılarak, sonraki uygulamalar için uygun olan bütün haldeki virüslerin geri kazanılmasını sağlar.

Protokol

1. Ultrasantrifüjasyon ile Viral Partiküllerin Konsantrasyonu

NOT: İki aşamadan oluşan; bir sakroz gradyanı aşaması ve bir sakroz yastığı aşamasını içeren çift sakrozlu bir saflaştırma yöntemi kullanıyoruz (Şekil 1).

1. Bir sakroz gradyanı oluşturmak için konik ultrasantrifüg tüplerini şu sırayla doldurun: 0.5 mL %70 sakroz (1x fosfat tamponlu salin [PBS] içinde çözülmüş), 0.5 mL %60 sakroz (DMEM içinde çözülmüş), 1 mL %30 sakroz (Dulbecco's Modified Eagle Medium [DMEM] içinde çözülmüş) ve 2 mL %20 sakroz (1x PBS içinde çözülmüş).
2. Virüs içeren süpernatantı dikkatlice gradyana ekleyin. Dört adet 15 cm plakadan elde edilen toplam süpernatant hacmi 100 mL olduğundan, virüs süpernatantının tüm hacmini işlemek için her çevrimde altı ultrasantrifüg tüpü kullanın.
   1. Bu adımda kullanılan her bir ultrasantrifüg tüpü, (sakroz hacmi dahil) 30 mL'ye kadar hacim kapasitesine sahiptir. Sıçramayı önlemek için en az %10 boşluk bırakarak viral süpernatantı tüplere eşit şekilde dağıtın.
   2. Her deneyde dörtten fazla 15 cm plak kullanılıyorsa, birleştirilmiş viral süpernatantın nihai hacminin altı ultrasantrifüg tüpüne kolayca sığabilmesi için kültür hacmini plak başına ~20 - 22 mL olarak ayarlayın.
   3. Ultrasantrifüg tüplerini toplam hacim kapasitelerinin en az dörtte üçüne kadar doldurun; aksi takdirde santrifüj sırasında tüpler kırılabilir, bu da olası numune kaybına ve/veya ekipman hasarına yol açabilir.
3. Tüpleri 1x PBS ile dengeleyin ve numuneleri 17 °C'de 2 saat boyunca 70,000 x g'de santrifüjleyin.
   NOT: Hızlanma sırasında sakroz tabakasının bozulmasını önlemek için, ultrasantrifügü çevrimin ilk 3 dakikasında rotoru yavaşça 200 rpm'e çıkaracak şekilde ayarlayın. Benzer şekilde, ultrasantrifügü çevrimin sonunda rotoru 3 dakika içinde 200 rpm'den 0 rpm'e yavaşça düşürecek şekilde ayarlayın.
4. %30 - 60 sakroz fraksiyonlarını dikkatlice temiz tüplere toplayın (Şekil 1). Birleştirilen fraksiyonlara soğuk 1x PBS ekleyerek hacmi 100 mL'ye tamamlayın; birkaç kez pipetle çekip bırakarak karıştırın.
5. Viral preparatı dikkatlice bir sakroz yastığı (sucrose cushion) üzerine katmanlayarak sakroz yastığı adımına geçin. Bunun için tüpe 4 mL %20 sakroz (1x PBS içinde) ekleyin ve ardından tüp başına ~20 - 25 mL viral solüsyon ekleyin. Tüpler dörtte üçten daha az doluysa, steril 1x PBS ile tamamlayın.
6. Numuneleri daha önce olduğu gibi dikkatlice dengeleyin ve 17 °C'de 2 saat boyunca 70,000 x g'de santrifüjleyin. Süpernatantı dökün ve tüpleri kağıt havlular üzerine ters çevirerek kalan sıvının süzülmesini sağlayın.
7. Pellet üzerindeki tüm sıvıyı uzaklaştırmak için kalan damlacıkları aspire edin. Bu aşamada, virüs içeren pelletler küçük şeffaf noktalar şeklinde çok hafifçe görülmelidir.
8. İlk tüpe 70 µL 1x PBS ekleyip süspansiyonu iyice pipetleyerek ve ardından süspansiyonu bir sonraki tüpe aktarıp daha önce olduğu gibi karıştırarak, tüm pelletler resüspan olana kadar işleme devam ederek pelletleri resüspan edin.
9. Tüpleri ek 50 µL soğuk 1x PBS ile durulayın ve daha önce olduğu gibi karıştırın. Nihai süspansiyonun toplam hacminin ~120 µL olduğundan ve hafif sütlü göründüğünden emin olun; masaüstü bir mikrocentrifüj ile 10,000 x g'de 30 saniye santrifüjleyerek berraklaştırın.
10. Süpernatantı taze bir mikrofüj tüpüne aktarın, 10 µL'lik alikotlar hazırlayın ve -80 °C'de saklayın.
    NOT: Lentiviral numuneler üzerinde tekrarlanan dondurma-çözme döngüleri yapmaktan kaçının. Santrifüj gerektiği durumlar dışında, kalan adımların uygun biyogüvenlik önlemleri kullanılarak doku kültürü davlumbazlarında veya belirlenmiş doku kültürü odalarında yürütülmesine özen gösterilmelidir.

Sonuçlar

Şekil 1: Çift sakkaroz gradyan protokolü kullanılarak viral partiküllerin konsantrasyonu. Süpernatanttan (SN) toplanan viral partiküller, sakkaroz gradyanına yüklenir. Gradyanı oluşturmak için %70, %60, %30 ve %20'lik sakkaroz çözeltileri kullanılır. Santrifüjün ardından, %30-60'lık sakkaroz fraksiyonlarından toplanan partiküller, daha sonra %20'lik bir sakkaroz yastığına yüklenir ve çöktürülür. Purifiye edilmiş viral partikülleri içeren nihai pelet, daha sonraki kullanımlar için 1x PBS içinde resüspande edilir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Ekipman
Optima XPN-80 Ultracentrifuge	Beckman Coulter	A99839
Allegra 25R tabletop centrifuge	Beckman Coulter	369434
Konik tabanlı ultrasantrifüg tüpleri	Seton Scientific	5067
Konik tüp adaptörleri	Seton Scientific	PN 4230
SW32Ti swinging-bucket rotor	Beckman Coulter	369650
50mL konik santrifüg tüpleri	Corning	430291
Doku kültürü pipetleri, 25 mL	Corning	4489