Enzim Bağlı İmmünosorbent Assay Kullanarak Lentiviral Titrenin Değerlendirilmesi

Özet

Kaynak: Vijayraghavan, S., et al. Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells. J. Vis. Exp. (2017).

Bu video, lentiviral vektörlerin viral titrelerini tahmin etmek için p24 ELISA kullanımını göstermektedir. Analiz, p24'ü serbest bırakmak için viral partiküllerin liz edilmesini, bunun spesifik antikorlarla yakalanmasını ve ölçülebilir bir renk değişimi oluşturan peroksidaz bağlantılı bir sistemle tespit edilmesini içerir. Örnek absorbans değerleri bir standart eğri ile karşılaştırılarak viral titresi nicelendirilir.

Protokol

1. Viral Titrelerin Tahmin Edilmesi

1. p24 (İnsan İmmün Yetmezlik Virüsü (HIV)-1 p24 kapsid proteini) - enzim bağlı immünosorbent analiz (ELISA) yöntemi NOTU: Analiz, NIH AIDS Aşı Programı'nın HIV-1 p24 Antijen Yakalama Analiz Kiti (bkz. Materyal Tablosu) talimatlarına uygun olarak, modifikasyonlarla, yüksek bağlama kapasiteli 96 kuyucuklu plakalar kullanılarak gerçekleştirilir.
   1. Ertesi gün, kuyucukları soğuk PBS içinde %0,05 Tween 20 içeren 20 µL (PBS-T çözeltisi) ile üç kez yıkayın. Plakayı, 1x PBS içinde 1:1500 dilüsyonda 10 µL monoklonal anti-p24 antikor ile kaplayın ve 4 °C'de gece boyunca inkübe edin.
   2. Spesifik olmayan bağlanmayı önlemek için, plakayı PBS içinde %1 BSA içeren 20 µL ile bloke edin; oda sıcaklığında en az 1 saat boyunca soğuk PBS içinde %0,05 Tween 20 içeren 20 µL (PBS-T çözeltisi) ile üç kez yıkayın.
   3. Numuneleri hazırlayın: Konsantre vektör preparatları için, numunenin 1 µL'sine 89 µL dd-H20 ve 10 µL Triton X-10 (final konsantrasyonu %10) ekleyerek numuneyi 10 kat dilüye edin. Konsantre olmayan preparatlar için, on kat dilüye edilmiş numuneler hazırlayın (10 µL numuneye 80 µL dd-H20 ve 10 µL Triton X-100 (final konsantrasyonu %10) ekleyin). NOT: Numuneler, sonraki kullanımlar için bu aşamada -20 °C'de uzun bir süre saklanabilir.
   4. 2 katlı seri dilüsyon uygulayarak (başlangıç konsantrasyonu 5 ng/mL olacak şekilde) HIV-1 standartlarını hazırlayın.
   5. Konsantre numuneleri (1:10 ön dilüye edilmiş stoklardan), %0,2 Tween 20 ve %1 BSA ile desteklenmiş RPMI 1640 (Roswell Park Memorial Institute 1640 besiyeri) içinde 1:10.0, 1:50.0 ve 1:250.0 dilüsyonları oluşturacak şekilde dilüye edin. Konsantre olmayan numuneleri (1:10 ön dilüye edilmiş stoklardan), %0,2 Tween 20 ve %1 BSA ile desteklenmiş RPMI 1640 içinde 1:50, 1:2500 ve 1:12.50 dilüsyonları oluşturacak şekilde dilüye edin.
   6. Numuneleri plakaya üç tekrarlı (triplicate) olarak uygulayın ve 4 °C'de gece boyunca inkübe edin.
   7. Ertesi gün, kuyucukları altı kez yıkayın ve RPMI 1640, %10 FBS, %0,25 BSA ve %2 normal fare serumu (NMS) içinde 1:100 oranında dilüye edilmiş 10 µL poliklonal tavşan anti-p24 antikoru ile 37 °C'de 4 saat boyunca inkübe edin.
   8. Yukarıdaki gibi altı kez yıkayın ve %5 normal keçi serumu, %2 NMS, %0,25 BSA ve %0,01 Tween 20 ile desteklenmiş RPMI 1640 içinde 1:10.0 oranında dilüye edilmiş keçi anti-tavşan yaban turpu peroksidaz IgG ile 37 °C'de 1 saat boyunca inkübe edin.
   9. Plakayı yukarıdaki gibi yıkayın ve TMB (3,3′,5,5′-Tetrametilbenzidin) peroksidaz substratı ile oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe edin.
   10. 10 µL 1 N HCL ekleyerek reaksiyonu durdurun. Absorbans plaka okuyucusu kullanarak numune absorbansını 450 nm'de ölçün.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
p24 ELISA reaktifleri
Monoklonal anti-p24 antikoru	NIH AIDS Research and Reference Reagent Program	3537
HIV-1 standartları	NIH AIDS Research and Reference Reagent Program	SP968F
Poliklonal tavşan anti-p24 antikoru	NIH AIDS Research and Reference Reagent Program	SP451T
Keçi anti-tavşan yaban turpu peroksidaz IgG	Sigma Aldrich	12-348	Çalışma konsantrasyonu 1:150
Normal fare serumu, Steril, 50mL	Equitech-Bio	SM30-050
Keçi serumu, Steril, 10mL	Sigma	G9023	Çalışma konsantrasyonu 1:10
TMB peroksidaz substratı	KPL	5120-076	Çalışma konsantrasyonu 1:10,0