Plazmit Transfeksiyonu Yoluyla Rekombinant Adeno-İlişkili Virüs Üretimi

Özet

Kaynak: Ding, J., et al. Preparation of rAAV9 to Overexpress or Knockdown Genes in Mouse Hearts. J. Vis. Exp. (2016)

Bu video, memeli hücrelerde plazmit transfeksiyonu yoluyla rekombinant adeno-ilişkili virüs partiküllerinin üretimini göstermektedir. Videoda, çekirdek içerisinde viral genom replikasyonunu ve kapsid montajını yönlendiren Rep, Cap ve yardımcı proteinlerin koordineli ekspresyonu vurgulanmaktadır.

Protokol

1. HEK293 Hücrelerinin rekombinant adeno-ilişkili virüs 9 (rAAV9) Plazmidleri ile Transfeksiyonu

1. Hazırlayın 1 µg/µl lineer polietilenimin (PEI) çözeltisinin. PEI tozunu endotoksin içermeyen dH2O içerisinde çözün₂70- dereceye ısıtılmış O80 °COda sıcaklığına soğuduktan sonra, çözeltiyi 1 M HCl ile pH 7.0'ye nötralize edin. Çözeltiyi filtre ile sterilize edin (0.22 µmçözeltiyi. Stok çözeltiyi alikotlayın 1 µg/µl PEI stok çözeltisi (1,400 µl/tube) ve çözeltiyi -20 °C.
2. HEK293 hücrelerini %10 Fetal Bovine Serum (FBS) ve %1 penisilin/streptomisin içeren Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) içinde kültüre edin. Hücreleri bir 37 °C %5'li inkübatör ± %0,5 karbondioksit (CO2)₂).
3. 0. günde, HEK293 hücrelerini transfeksiyondan 18-20 saat önce, %90'dan fazla konfluensle ulaşmış hücreleri 1:2 oranında seyrelterek on adet 150 mm'lik kaba ekimleyin > %90 konfluensle ulaşmış hücrelerin 1:2 dilüsyonu.
   NOT: 1. günde hücreler %90 konfluense ulaşmalıdır.
4. 1. günde, HEK293 hücrelerini rAAV9 plazmidi (örneğin rAAV9.cTNT::GFP veya rAAV6.U6::shRNA konstrüktleri), Ad-Helper plazmidi ve AAV-Rep/Cap plazmidi ile PEI kullanarak transfekte edin.
   1. %90 konfluense ulaşmış 10 kap hücre için şunları karıştırın: 70 µg AAV-Rep/Cap plazmidinin, 70 µg rAAV9 plazmidi ve 200 µg 50 ml'lik bir santrifüj tüpünde Ad-Helper plazmidi.
   2. Hücreler daha az konfluens ise, DNA miktarını orantılı olarak ayarlayın. Örneğin, hücreler %75 konfluens düzeyindeyse, DNA miktarını orantılı olarak azaltın (adım 1.4.1'de gösterilen miktarın 75/90'ı): 70 x 75/90 = 58.3 µg AAV-Rep/Cap plazmidinin, 70 x 75/90 = 58.3 µg rAAV9 plazmidi ve 200 x 75/90 = 166.7 µg Ad-Helper plazmidini 50 ml'lik bir santrifüj tüpüne ekleyin.
   3. 50 ml'lik tüpe 49 ml oda sıcaklığında DMEM (FBS içermeyen) ekleyin ve iyice karıştırın.
   4. Ekleyin 1,360 µl PEI:DNA oranının (v/w) 4:1 olması için PEI çözeltisi ekleyin. İyice karıştırın. Oda sıcaklığında 15 - 30 dakika inkübe edin.
   5. Adım 1.4.4'te hazırlanan karışımdan her bir 150 mm'lik kaba 5 ml ekleyin (on adet 150 mm'lik kap için toplam 50 ml karışım).
5. Hücreleri bir 37 °C %5'lik inkübatör ±%0,5 CO2₂ 60-72 saat boyunca.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Polietilenimin, Lineer (MW 25,000)	Polysciences, Inc.	#23966-2
Tüp, Polipropilen, 36.2 ml, 25 x 87 mm, (adet 56)	Beckman Coulter, Inc	# 362183
DMEM ortamı	Fisher Scientific	SH30243FS
Fetal Bovin Serum	Atlanta Biologicals	S11150
rAAV9 vektörü	Penn Vector Core	P1967