Transfekte Edilmiş İnsan Böbrek Hücrelerinden Rekombinant Virüs Partiküllerinin Saflaştırılması

Özet

Kaynak: Ding, J. et. al., Fare Kalplerinde Genlerin Aşırı Eksprese Edilmesi veya Susturulması için rAAV9 Hazırlanması. J. Vis. Exp. (2016)

Bu video, transfekte edilmiş insan böbrek hücrelerinden rekombinant virüs partiküllerinin saflaştırılmasını göstermektedir. Virüs, dondurma-çözme lizisi ile serbest bırakılır ve blok kopolimer destekli filtrasyon ile iodixanol gradyanları kullanılarak saflaştırılır.

Protokol

1. HEK293 Hücrelerinin Rekombinant Adeno-İlişkili Virüs 9 (rAAV9) Plazmidleri ile Transfeksiyonu
   1. Hazırlayın 1 µg/µl lineer polietilenimin (PEI) çözeltisinin. PEI tozunu endotoksin içermeyen dH2O içinde çözün₂70°C'ye kadar ısıtılmış olan O80 °COda sıcaklığına (RT) soğuduktan sonra, çözeltiyi 1 M hidroklorik asit (HCl) ile pH 7,0'ye nötralize edin. Filtre sterilizasyonu yapın (0.22 µm) çözeltiyi. Şunları alikotlayın: 1 µg/µl PEI stok çözeltisi (1,400 µl/tube) ve çözeltiyi - derecede saklayın20 °C.
   2. HEK293 hücrelerini %10 fetal bovine serum (FBS) ve %1 penisilin/streptomisin içeren Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) içerisinde kültüre edin. Hücreleri bir 37 °C 5 derece sıcaklıktaki inkübatör ± %0,5 karbondioksit (CO₂).
   3. 0. günde, transfeksiyondan 18-20 saat önce, HEK293 hücrelerini pasajlayarak on adet 150 mm'lik tabağa ekin. > 1:2 dilüsyonda %90 konfluen hücreler.
      NOT: 1. günde hücreler %90 konfluense ulaşmış olmalıdır.
   4. 1. günde, HEK293 hücrelerini PEI kullanarak rAAV9 plazmidi (örneğin, rAAV9.cTNT::GFP veya rAAV6.U6::shRNA konstrüktları), Ad-Helper plazmidi ve AAV-Rep/Cap plazmidi ile transfect edin.
      1. %90 konfluense ulaşmış 10 hücre plağı için şunları karıştırın: 70 µg AAV-Rep/Cap plazmidinin, 70 µg pfrAAV9 plazmidi ve 200 µg 50 ml'lik bir santrifüj tüpü içerisindeki Ad-yardımcı plazmidinin.
      2. Hücrelerin konfluens oranı daha düşükse, DNA miktarını orantılı olarak ayarlayın. Örneğin, hücreler %75 konfluens düzeyindeyse, DNA miktarını orantılı olarak azaltın (adım 2.4.1'de belirtilen miktarın 75/90'ı): 70 x 75/90 = şeklinde karıştırın. 58.3 µg AAV-Rep/Cap plazmidinden, 70 x 75/90 = 58.3 µg rAAV9 plazmidinin, ve 200 x 75/90 = 166.7 µg 50 ml'lik bir santrifüj tüpü içerisindeki Ad-Helper plazmidinin
      3. 50 ml'lik tüpe 49 ml oda sıcaklığında DMEM (FBS içermeyen) ekleyin ve iyice karıştırın.
      4. Ekleyin 1,360 µl PEI:DNA oranını (h/a) 4:1 yapacak şekilde PEI çözeltisinden ekleyin. İyi bir şekilde karıştırın. Oda sıcaklığında 15 - 30 dakika inkübe edin.
      5. Adım 1.4.4'te hazırlanan karışımdan her bir 150 mm'lik petri kabına 5 ml ekleyin (on adet 150 mm'lik petri kabı için toplam 50 ml karışım).
   5. Hücreleri bir ... içinde kültüre edin 37 °C 5%'li inkübatör ±%0,5 CO₂ 60-72 saat boyunca.
2. Transfekte Edilmiş HEK293 Hücrelerinin Hasadı ve rAAV9 Vektörlerinin Saflaştırılması
   1. Hücreleri transfeksiyondan 60-72 saat sonra hasat edin. Kaplardaki hücreleri, kültür medyumu ile pipetleyerek yerlerinden ayırın ve süspansiyona alın. Tüm hücre süspansiyonlarını steril 50 ml'lik tüplere aktarın.
   2. Hücreleri 50 x g'de 5 dakika boyunca santrifüjleyin. Her tüpteki hücre peletini 5 ml fosfat tamponlu salin (PBS) ile yeniden süspande edin ve tüm hücre süspansiyonlarını tek bir 50 ml'lik tüpte birleştirin.
   3. Hücreleri 50 x g'de 5 dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatantı atın. Bu aşamada hücre peletini -da saklayın.80 °C veya 2.4-2.15. adımlarda açıklandığı gibi AAV'yi peletten hemen saflaştırın.
   4. Lizis tamponunu hazırlayın: 150 mM sodyum klorür (NaCl) ve 20 mM Tris(hidroksimetil)aminometan Hidroklorür (Tris-HCl, pH 8,0). Filtreyle sterilize edin (0.22 µM). Tamponu şu sıcaklıkta saklayın: 4 °C.
   5. Peleti 10 ml lizis tamponu ile yeniden süspande edin.
   6. Lizatı -da dondurun80 °C veya kuru buz/etanol banyosunda, ardından şu sıcaklıkta çözün: 37 °C1 dakika boyunca vorteksleyin. Lizatı 3 kez dondurup çözün.
   7. Magnezyum klorür (MgCl2) ekleyin₂) çözeltisini çözülmüş lizata ekleyin (final MgCl2 konsantrasyonunu şu şekilde ayarlayın:₂ lizatta 1 mM olacak şekilde). Nükleazı 250 U/ml nihai konsantrasyona ulaşacak şekilde ekleyin. Şurada inkübe edin: 37 °C DNA/protein agregasyonunu çözmek için 15 dk boyunca.
      NOT: Nükleaz veya endonükleaz işlemi sonrası DNA/protein agregasyonu çözülmezse, lizatları dounce homogenizatör ile 20 kez homojenize edin.
   8. Numuneyi 4.80 x g'de 20 dakika boyunca santrifüjleyin 4 °CSüpernatantı toplayın.
   9. Bu sırada, Iodixanol gradyan çözeltisini hazırlayın:
      1. 5 ml 10x PBS ve 0,05 ml 1 M MgCl₂ karıştırarak gradyan solüsyonunun %17'lik kısmını hazırlayın.₂, 0,125 ml 1 M potasyum klorür (KCl), 10 ml 5 M NaCl ve 12,5 ml yoğunluk gradyanı medyumu. Toplam hacmi H₂O kullanarak 50 ml'ye tamamlayın.₂O.
      2. 5 ml 10x PBS ve 0,05 ml 1 M MgCl₂ karıştırarak %25'lik çözeltiyi hazırlayın.₂, 0,125 ml 1 M KCl, 20 ml yoğunluk gradyanı ortamı ve 0,2 ml %0,5 (a/h) Fenol Kırmızısı. Toplam hacmi H kullanarak 50 ml'ye tamamlayın₂O.
      3. 5 ml 10x PBS ve 0,05 ml 1 M MgCl2 karıştırarak %40'lık çözeltiyi hazırlayın.₂, 0,125 ml 1 M KCl ve 3,3 ml yoğunluk gradyanı medyumu. Toplam hacmi H kullanarak 50 ml'ye tamamlayın₂O.
      4. 1 M MgCl2'den 0,05 ml karıştırarak %60'lık çözeltiyi hazırlayın₂, 0,125 ml 1 M KCl, 50 ml yoğunluk gradyanı medyumu ve 0,1 ml %0,5 (w/v) Fenol Kırmızısı.
   10. Bir iğne ve şırınga yardımıyla, Iodixanol gradyan çözeltisini polipropilen tüpe, alttan başlayarak sırasıyla 5 ml %17, 5 ml %25, 5 ml %40 ve 5 ml %60 olacak şekilde yükleyin. Adım 3.8'den elde edilen tüm lizatı (14-16 ml) gradyanın üzerine ekleyin. Alttan üste doğru sıralanan gradyan; %60, %40, %25, %17 ve lizat tabakasından oluşmaktadır. Tüpü lizis tamponu ile doldurun ve mantarla kapatın.
   11. 185.0 x g'de 90 dakika boyunca santrifüjleyin 16 °C.
   12. Viral fraksiyonu (%40'lık tabaka) bir şırınga ile toplayın. İğneyi (21 gauge), %40 ve %60'lık fraksiyonların kesişim noktasına yerleştirin ve yalnızca %40'lık tabakayı aspire edin.
       NOT: %25'lik katmanı aspire etmekten kaçının.
   13. Viral fraksiyonu, toplam hacim 15 ml olana kadar sterilize edilmiş polioksietilen-polioksipropilen blok kopolimer PBS çözeltisiyle (PBS içinde 1:10.0 oranında seyreltilmiş %10'luk polioksietilen-polioksipropilen blok kopolimer stok çözeltisi) karıştırın. Karışımı filtre tüpüne (kesme ağırlığı MW = 10 kD) yerleştirin. 2.00 x g'de 30 dakika boyunca santrifüjleyin. 4 °C.
   14. Alttaki solüsyonu atın. Filtre tüpünü, toplam hacim 15 ml olacak şekilde poliyoksietilen-poliyoksipropilen blok kopolimer PBS solüsyonu ile yeniden doldurun. 2.0 x g'de 20 dakika boyunca santrifüjleyin. 4 °CBu adımı iki kez daha tekrarlayın. Saflaştırılmış rAAV9 virüsünü (filtre üzerindeki fraksiyonu) toplayın.
   15. Filtre tüpündeki saflaştırılmış rAAV9'u 1,7 mL'lik tüplere aktarın. Saflaştırılmış rAAV9'u (10 - 400 µl/tube, (AAV'nin hacmine ve titerine bağlı olarak) ve virüsü - derecede saklayın80 °C.
       NOT: Tekrarlanan dondurma-çözme işlemlerinden kaçının.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Polietilenimin, lineer (MW 25,0)	Polysciences, Inc.	#2396-2
Tüp, polipropilen, 36.2 ml, 25 x 87 mm, (adet 56)	Beckman Coulter, Inc	# 362183
Nükleaz, ultrapure	SIGMA	#E8263-25KU
Yoğunluk gradyanı medyumu (Iodixanol)	SIGMA	#D156-250ML
Ultracel-10 membranlı santrifüj filtre ünitesi	EMD Millipore Corporation	#UFC91008
90° küt uçlu, gauge 14, L 6 in., nikel kaplı hub laboratuvar pipetleme iğnesi	SIGMA	#CAD7942-12EA
Poloksamer 18 çözeltisi (Pluronic® F-68 çözeltisi)	SIGMA	P556-10ML
Proteinaz K	SIGMA	311582801
DNase I	Roche	1010415901
Santrifüj cihazı	Thermo Scientific	7504260
Santrifüj Sistemi	Beckman Coulter	36318
Ultrasantrifüj	Beckman Coulter
DMEM medyumu	Fisher Scientific	SH30243FS
Fetal sığır serumu	Atlanta Biologicals	S150
rAAV9 vektörü	Penn Vector Core	P1967