Viral Onkogenlerin Retroviral Transdüksiyonu Yoluyla Endotelyal Hücrelerin Ölümsüzleştirilmesi

Özet

Kaynak: McAllister, S. C., Hanson, R. S., et al. An In Vitro Model for Studying Cellular Transformation by Kaposi Sarcoma Herpesvirus. J. Vis. Exp.(2017)

Bu video, primer endotel hücrelerinin HPV16 E6/E7 onkogenleri ile retroviral transdüksiyonunu göstermektedir. Entegre edilen onkogenler, p53 ve Rb tümör baskılayıcılarını inaktive ederek hücre ömrünü uzatır. G418 seçilimi transdükte edilmiş hücreleri zenginleştirerek, transformasyon çalışmaları için uygun ölümsüzleştirilmiş endotel kültürleri sağlar

Protokol

Endotel hücrelerin (EC) E6 ve E7 Papillomavirus Genleri ile Transdüksiyonu

NOT: Primer EC yetiştirmek için rutin olarak standart doku kültürü flaskları kullanıyoruz. Ancak, EC'lerin büyümesi yetersiz kalırsa, ticari kültür flasklarının kullanımı değerlendirilmelidir.

1. Primer human dermal mikrovasküler veya lenfatik EC'leri, EC büyüme ortamında (EGM; EGM-2 BulletKit [fetal bovine serum, hidrokortizon, insan fibroblast büyüme faktörü-B, vasküler EC büyüme faktörü, insülin benzeri büyüme faktörü-1, askorbik asit, insan epitel büyüme faktörü, antibiyotikler ve heparin içerir] ile desteklenmiş EC bazal ortamı [EBM] içerir), nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 °C ve %5 CO₂ altında, T75 hücre kültürü flaskında yaklaşık %50 konfluense ulaşana kadar kültüre edin.
2. Transdüksiyon için, PA317 LXSN 16E6E7 hücrelerini %10 fetal bovine serum ve antimikrobiyaller ile desteklenmiş Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) içinde, nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 °C ve %5 CO₂ altında, T150 hücre kültürü flaskında yaklaşık %90 konfluense ulaşana kadar kültüre edin. Ardından, 16 mL ortamda gece boyunca inkübe edin.
3. PA317 ortamını, oda sıcaklığında 5 dk boyunca 30 × g'de santrifüj ederek berraklaştırın.
4. EGM'yi EC kültüründen uzaklaştırın, hücrelerin üzerine 12 mL berraklaştırılmış PA317 ortamı ekleyin ve 4 sa boyunca inkübe edin.
   NOT: 16 mL kondisyonlu ortamın 30 × g'de 5 dk santrifüj edilmesi, 12 mL berraklaştırılmış süpernatantın dikkatlice alınmasıyla bozulmayacak kompakt bir pelet oluşmasını sağlar. Ancak, PA317 LXSN 16E6E7 hücrelerinin primer EC kültürlerine transferi konusunda endişe varsa (paketleme hücre hattı, EC'leri hızla baskılayacaktır), transferden önce kondisyonlu süpernatantın 0.45 µm'lik bir filtredenle süzülmesi işlemi gerçekleştirilebilir.
5. PA317 ortamının 6 mL'sini taze EGM ile değiştirin ve gece boyunca inkübe edin.
6. EC'leri 12 mL taze EGM ile tekrar besleyin ve 48 sa daha inkübe edin.
7. EC'lerin alt kültürü için ortamı uzaklaştırın, katyon içermeyen 12 mL fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın, 3 mL ticari enzimatik disosiyasyon çözeltisi (örneğin TrypLE) ekleyin ve 37 °C'de 3 dk inkübe edin.
8. Hücre süspansiyonunu 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın ve oda sıcaklığında 5 dk boyunca 30 × g'de santrifüj edin. Oluşan hücre peletini taze EGM içinde yeniden süspanse edin ve flask başına 12 mL EGM olacak şekilde 3 × T75 flaskına eşit olarak paylaştırın.
9. E6 ve E7 ile transdükte edilmiş EC'leri seçmek için, iki pasaj boyunca 200 µg/mL nihai konsantrasyonda G418 ekleyin; bunun ardından transdükte edilen EC'ler enfeksiyon için ekilebilir veya sıvı azot içerisinde dondurulabilir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
BCBL-1 hücreleri	NIH AIDS Reaktif Programı	3233
PA317 hücreleri	ATCC	CRL-203
Neonatal dermal mikrovasküler endotel hücreleri	Lonza	CC-2505
EBM-2 Bazal Besiyeri	Lonza	CC-3156
EGM-2 BulletKit	Lonza	CC-3162
RPMI
DMEM
kalsiyum ve magnezyumlu PBS