Elektron Mikroskobu Kullanılarak Faustovirus'un Görselleştirilmesi ve Boyut Değerlendirmesi

Özet

Kaynak: Bou Khalil, J. Y., et al. A Rapid Strategy for the Isolation of New Faustoviruses from Environmental Samples Using Vermamoeba vermiformis. J. Vis. Exp. (2016).

Bu video, iletim elektron mikroskopisi kullanılarak enfekte bir amip kültüründeki faustovirus partiküllerinin görüntülenmesini göstermektedir. Video; grid hazırlama, kontrastı artırmak için amonyum molibdat ile negatif boyama ve virüsün mikroskop altında görselleştirilmesi aşamalarını kapsamaktadır. Protokol, mikroskobun entegre yazılım araçları kullanılarak faustovirus boyutunun ölçülmesiyle sona ermektedir.

Protokol

1. Elektron Mikroskobu
   1. Lamlar üzerindeki ilk tanımlamanın ardından, süpernatan kültürlerin elektron mikroskobu ile gözlemi yoluyla dev virüsün varlığını değerlendirin.
   2. Pozitif örnekten 5 µl'yi glow-discharge edilmiş ızgara üzerine damlatın. Oda sıcaklığında yaklaşık 20 dakika bekleyin.
   3. Izgarayı dikkatlice kurutun ve üzerine 10 saniye boyunca küçük bir damla %1 amonyum molibdat ekleyin. Izgaranın kuruması için 5 dakika bekleyin.
   4. 200 keV'de elektron mikroskobu incelemesine geçin.
   5. Izgarayı tutucuya yerleştirin; tutucuyu mikroskoba takın. İlgili simgeye tıklayarak vakum genel bakışını kontrol edin. Valfleri kapatın ve spot size 5 ile x 25,000 büyütmede gözleme başlayın.
   6. Dev virüsü ImageJ kullanarak veya doğrudan mikroskop üzerinde, görüntüleme ekranında bulunan ölçüm aracını kullanarak ölçün.
      NOT: Yaklaşık 200 nm kapsid boyutuna sahip örneği Faustovirus grubuna sınıflandırın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Amoeba suşu CDC-19	ATCC	France	50237
Plakalar	Cellstar	France	655180
Vakum destekli filtreler	Thermo scientific	France	BPV4550 / 20170115
Fosfat Tamponlu Salin	Thermo Fisher scientific	France	10010-023
DAPI boyası	Life Technologies	France	D1306
Karbon ızgaralar	Euromedex	France	FCF400NI
Amonyum molibdat	VWR internationanl	France	21276185
Erlenmayerler	SARSTEDT	Germany	833911
0.22 μm Filtreler	Milex millipor	France	SE2M229104
Ultrasantrifüj Sorval WX 80	Thermo scientific	France	9102448
Hızlı akışlı filtreler	Nalgene	France	450-0020