Floresan İn Situ Hibridizasyonu ile Konak Hücrelerde Viral RNA Dağılımının Belirlenmesi

Özet

Kaynak: Vallery, T. K. & Steitz, J. A. Quantitative Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) and Immunofluorescence (IF) of Specific Gene Products in KSHV-Infected Cells. J. Vis. Exp. (2019)

Bu video, virüsle enfekte olmuş hücrelerde viral RNA'yı görselleştirmek için floresan in situ hibridizasyon yöntemini göstermektedir. Prob hibridizasyonu, sinyal amplifikasyonu ve konfokal görüntüleme süreçlerinde yer alan adımları ana hatlarıyla açıklamaktadır.

Protokol

1. Viral RNA'ların Fiksasyonu, Hibritizasyonu ve Görselleştirilmesi

1. Besiyerini ve fazla hücreleri uzaklaştırın. Bu protokol boyunca, solüsyonları uzaklaştırmak için vakum emişi ve solüsyonları eklemek için nazik mikropipetleme uygulayın.
   NOT: Vakum gücü, cam Pasteur pipeti üzerine 20 µL mikropipet ucu yerleştirilerek azaltılabilir. Kontaminasyonu önlemek için yıkama basamakları arasında mikropipet ucunu değiştirin. Hücrelerin asla kurumaması kritik olduğundan, her yıkama basamağı hızlıca gerçekleştirilmelidir.
2. Hücreleri derhal, buz üzerinde 30 dakika boyunca önceden soğutulmuş %4 formaldehit/PBS (fosfat tamponlu salin) ile fikse edin. Hücreleri 4 °C'ye soğutulmuş 200 µL 1x PBS ile üç kez yıkayın ve oda sıcaklığında veya buz üzerinde 5 dakika inkübe edin.
   1. Fikse edilmiş hücreleri, buz üzerinde 10 dakika boyunca 20 µL önceden soğutulmuş %0,5 Triton-X/PBS ile veya 4 °C'de 1 saat (min) ile 7 gün (maks) arasında 750 µL önceden soğutulmuş %70 etanol ile permeabilize edin.
      NOT: Aksi belirtilmedikçe, bu protokol boyunca tüm yıkamalar aynı şekilde gerçekleştirilir. %70 etanol, odacıklar ile lam arasındaki yapıştırıcıyı gevşeterek daha sonra ayrılmayı kolaylaştırır ve protokolde önemli bir ara sağlar. Yine de, evaporasyonu azaltmak için odacıklı lamın etrafına parafin film kullanın ve her odacıktaki etanol seviyesini yaklaşık her 8 saatte bir kontrol edin. %70 etanol ayrıca hücreleri düzleştirerek daha net bir görüntü sağlar; Triton-X ise hücreleriyeye kurutmaz ve hücre boyutlarını değiştirmez.
3. Lamın çatlamasını önlemek için odacıkları dikkatlice çıkarın.
   NOT: Üretici tarafından sağlanan taze bir çıkarma cihazı veya üzerinde çok az kalıntı yapıştırıcı bulunan bir cihaz kullanın ve lamın çatlamasını önlemek için odacıkları nazikçe ayırın. Permeabilizasyon reaktifi olarak 4 saat boyunca %70 etanol kullanmak çatlama olasılığını büyük ölçüde azaltır. Çatlama durumunda, çatlakla etkilenmemiş odacıklarda protokole devam edin ve tam olarak mühürlenmemiş lamların daha yüksek oksidasyon hızına (yani azalmış saklama ömrüne) sahip olacağını unutmayın.
4. Hücreleri bir kez 2x SSC (salin sodyum sitrat) ile yıkayın ve ardından %50 formamid, %10 dekstran sülfat, 2x SSC, %0,1 sığır serum albümini (BSA), 500 µg/mL somon spermi denoksiribonükleik asit (DNA), 125 µg/mL E. coli transfer RNA (tRNA) ve 1 mM vanadil ribonükleozid komplekslerinden oluşan 45 µL hibridizasyon solüsyonu uygulayın. Nemlendirilmiş steril mendiller içeren 150 mm'lik bir Petri kabı olabilen bir nem odasında, 37 °C'de 1 saat inkübe edin.
   NOTE: Taze hibridizasyon solüsyonunu kullanımdan en az bir saat önce hazırlayın. Dekstran sülfatı önce suda çözün, sık sık vorteksleyin ve 37 °C'lik bir su banyosunda inkübe edin.
5. Odacık başına 35 µL hibridizasyon solüsyonunda önerilen 25 µM konsantrasyona ulaşmak için gereken oligonükleotid miktarını hesaplayın. Anti-sense oligonükleotid konsantrasyonunu gerektiği gibi ayarlayın. Denatürasyon hacmini 10 µL'ye getirmek için oligonükleotidlere distile su ekleyin.
   NOTE: Etiketleme reaksiyonunun ardından oligonükleotidler; 0,18 M potasyum kakodilat, 23 mM Tris-HCl, 0,23 mg/mL BSA, 4,5 mM CoCl₂, 18 mM etilendiaminotetraasetik asit (EDTA), 2,7 mM potasyum fosfat, 6,8 mM KCl, 45 µM 2-Merkaptoetanol, %0,02 Triton X-10 ve %2 gliserol içeren sönümlenmiş solüsyonda saklanır. Konsantrasyonlar yeterince yüksektir, öyle ki su ile seyreltme işlemi denatürasyon solüsyonunu, standart bir oligonükleotid denatürasyon tamponu olan 1x TE'ye (10 mM Tris-HCl ve 1 mM EDTA) yakın konsantrasyonlara getirecektir.
6. Digoksinen (DIG)- ve/veya Alexa Fluor 594 ile etiketlenmiş oligonükleotidleri 95 °C'de 5 dakika boyunca denatüre edin. Ardından, denatüre edilmiş oligonükleotidlere hedeflenen her odacık için 35 µL taze hibridizasyon solüsyonu ekleyin. Çift floresan in situ hibridizasyon (FISH) yapılacaksa, her iki anti-sense oligonükleotid seti birlikte denatüre edilebilir ve hibridize edilebilir.
7. Pre-hibridizasyon solüsyonunu uzaklaştırın ve ardından etiketli oligonükleotidleri içeren hibridizasyon solüsyonunu hücrelere ekleyin. Floroforla etiketlenmiş oligonükleotidleri korumak için alüminyum folyo ile kapatarak, nem odasında 37 °C'de gece boyunca inkübe edin.
   NOTE: İnkübasyon en az 10 saat ve en fazla 24 saat olmalıdır.
8. Ertesi gün, hücreleri 37 °C'de 10 dakika boyunca iki kez 2x SSC ile ve ardından 25 °C'de 10 dakika boyunca iki kez 1x SSC ile yıkayın.
9. Hücreleri buz üzerinde 10-15 dakika boyunca önceden soğutulmuş %4 formaldehit/1x PBS ile fikse edin. Ardından hücreleri üç kez PBS ile yıkayın ve 4 °C'de önceden soğutulmuş %70 etanol ile 1 saat veya önceden soğutulmuş %0,5 Triton-X/1x PBS ile 10 dakika boyunca permeabilize edin.
10. Hücreleri, önceden soğutulmuş %0,1 BSA/1x PBS içinde 1:20 anti-digoksinen (DIG)–floresan izotiyosiyanat (FITC) ile 4 °C'de 1 saat inkübe edin. Antikor solüsyonunu uzaklaştırın ve üç kez 1x PBS ile yıkayın.
11. 4 °C'de 10-15 dakika boyunca önceden soğutulmuş %4 formaldehit/1x PBS ile fikse edin ve ardından üç kez 1x PBS ile yıkayın.
12. Hücreleri, önceden soğutulmuş %0,5 Triton-X/1x PBS içinde 0,4 µg/mL 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) ile buz üzerinde 15 dakika inkübe edin ve ardından üç kez 1x PBS ile yıkayın.
13. Lamları floresan boncuklar (isteğe bağlı) ve bir kapatma medyumu ile kapatın. Ardından lamın üzerindeki kapatma camını şeffaf oje ile mühürleyin.
14. Bir konfokal mikroskop kullanarak, protokolü uyguladıktan sonra bir saat ile bir hafta arasında 630x büyütmede örneklerin görüntülerini toplayın. Kapatma camını mühürlemek ve oksidasyon hızını azaltarak florofor ömrünü uzatmak için birden fazla kat oje uygulayın.
    NOTE: DAPI içeren bir kapatma medyumu kullanmayın. Görüntüleri toplarken, daha sonra yapılacak kantifikasyon için her görüntüye ölçek çubuğu ekleyin. Floresan boncuklar, lamlar ve örnek hazırlıkları arasındaki floresan yoğunluğu için kontrol olarak hizmet eder. İki boyutlu (2D) kantifikasyon için görüntüleri hücrenin orta kesitinden alın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Anti-DIG FITC	Jackson Lab Immunologicals	200-092-156
Dekstran sülfat	Sigma Aldrich	D8906	Moleküler biyoloji saflığında
DIG-oligonükleotid kuyruklama kiti	Sigma Roche	#03353583910	2. Nesil
Sekiz odacıklı lamlar	Nunc Lab Tek II	#154453	Mavi sızdırmazlık bandı yüzey gerilimini artır ancak şeffaf jel ile ayırma seçeneği de mevcuttur.
Formamid	Sigma Aldrich	F9037	Moleküler biyoloji saflığında
Vanadil ribonükleozid kompleksleri	NEB	S1402S