Lizojenik Bakterilerde Spontan Faj İndüksiyonunun Zaman İçindeki Ölçümü

Özet

Kaynak: Krishnamurthi, R., et al. Understanding the Impact of Temperate Bacteriophages on Their Lysogens Through Transcriptomics. J. Vis. Exp. (2024).

Bu video, canlı bakteri hücrelerini (CFU'lar) ve enfeksiyöz faj partiküllerini (PFU'lar) zaman içinde nicelleştirerek, lizojenik Pseudomonas aeruginosa'da spontan faj indüksiyonunun zamansal sayımını göstermektedir. Büyüme sırasında belirli aralıklarla örnekleme yapılması ve hem koloni hem de plak oluşumunun analiz edilmesi sayesinde, bu yöntem spontan indüksiyonun ne zaman minimum düzeyde olduğunu ortaya koymaktadır. Bu durum, minimum litik girişimle birlikte, sonraki transkriptomik analizler için optimal zaman noktalarının belirlenmesine olanak tanır.

Protokol

1. Spontan indüksiyonun zamansal doğrudan sayımı (Şekil 1)

1. Tek bir koloniyi 5 mL LB (Luria–Bertani besiyeri) içine inoküle ederek hem lizojenin (örneğin, LES (Liverpool Epidemic Strain (LES) bakteriyofajları) fajları taşıyan P. aeruginosa PAO1 lizojeni) hem de indikatör konakçının (PAO1-Rif^R) (rifampisin-dirençli Pseudomonas aeruginosa PAO1) gece boyu başlangıç kültürlerini hazırlayın ve 180 rpm çalkalamayla 37 °C'de inkübe edin (18–24 sa).
2. Gece boyu kültürleri 1:100 oranında 100 mL LB'ye inoküle ederek taze lizojen ve indikatör konakçı kültürleri hazırlayın ve çalkalamayla (180 rpm) 37 °C'de inkübe edin.
   1. OD₆₀₀ ölçümü ve Miles Misra tekniğini kullanarak canlı sayımı yaparak lizojen büyümesini izleyin. Bunun için, inokülasyon anından itibaren 8 sa boyunca her saat başı her bir lizojen kültüründen 1 mL örnek toplayın.
   2. Örneği topladıktan hemen sonra, 100 µL örneği ilgili besiyerinin 900 µL'sine ekleyerek seri dilüsyon yapın. Maksimum hızda iyice vorteksleyin, her dilüsyon adımında ucu değiştirin ve dilüsyon serisini 10⁻¹ ile 10⁻⁹ arasında sürdürün.
   3. Gerekli dilüsyonların 10 µL'sini bir LB agar plakasına üç tekrarlı olarak damlatın, kurumaya bırakın ve 37 °C'de 18–24 sa boyunca inkübe edin.

   4. Canlı bakteri hücre sayısını hesaplamak için, kolayca sayılabilen kolonilerin olduğu bir dilüsyon bulun. Her damladaki koloni sayısını sayın ve ardından aşağıdaki formülü kullanın:
       

      

      
      NOT: Lizojen kültürü büyüdükçe, spontan indüksiyon yoluyla aktif faj partikülleri üretilecektir. İnfektif fajların üretimi, lizojen popülasyonunun transkriptomunun artık litik faj replikasyon sinyalinden kaynaklanan litik replikasyon döngüsüyle ilişkili gen ekspresyonu ve ilgili konak hücre yanıtı ile kontamine olduğu anlamına gelir. Bu nedenle, veri setindeki arka plan transkripsiyon gürültüsünü (litik faj transkriptomu tarafından oluşturulan) mümkün olduğunca sınırlamak için, lizojenik hücrelerin serbest infektif faj partiküllerine oranının en yüksek olduğu büyüme aşamasını belirlemek önemlidir.

3. Her bir zamansal örnekteki infektif faj partiküllerini saymak için, uygun bir seçici ajan varlığında (PAO1 konakçısının MIC değeri sadece 16 µg·mL⁻¹ olduğundan bu durumda 50 µg·mL⁻¹ rifampisin), 5 mL steril %0,4 LB'li bakteriyolojik agarı (üst agar), orta-eksponansiyel fazdaki indikatör konakçının (OD600: 0,4–0,5; bu durumda PAO1-Rif^R) 100 µL'si ile inoküle edin
   1. Aynı seri dilüsyonun (bkz. adım 1.2.2) 10 µL'sini inoküle edilmiş üst agar tabakasına damlatın, kurumaya bırakın ve ardından 37 °C'de 18–24 sa boyunca inkübe edin.

   2. İnfektif faj partiküllerini hesaplamak için, kolayca sayılabilen plakların olduğu bir dilüsyon bulun. Her damladaki plak sayısını sayın.
       

      

   3. Sonraki deneysel adımlar için, CFU (koloni oluşturan birim) başına spontan indüksiyonun minimum olduğu zamanı/koşulu belirleyin.

Sonuçlar

Şekil 1: Aynı örnekten bir lizojene ait PFU ve CFU'ların sayılmasına yönelik deneysel tasarım.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
PAO1		6
LESB58		6
LES faji	Norfloksasin kullanılarak LESB58'den indüklenmiş ve saflaştırılmıştır.
Lizojeni Besiyeri (LB)	Merck	1.10285.500
LB Agar	Merck	1.10283.500
Agar Agar	Fisher	A/1080/53
Üst Agar	100 mL su içinde 0.4 g Agar Agar+2.5 g LB Besiyeri; otoklavlayın ve kullanın.	-
Rifampisin	Sigma (Stok: Metanol içinde 50 mg/mL- İyice karıştırın, sterilize etmek için 0.22 µm filtre kullanın ve kullanıma kadar -20 °C'de saklayın)	R3501