Bu video, bakteriyel genoma entegre edilmiş bir profajda litik replikasyonun indüklenmesini ve zamana dayalı örnekleme yoluyla transkriptomik analiz için gen ekspresyon değişikliklerinin yakalanmasını göstermektedir.
Yöntem makalesi
Transkriptomik Analiz İçin Profaj Litik Replikasyonunun İndüklenmesi
10 görüntülenme
⸱
30 Eylül 2026
Bu makalede
Özet
Protokol
1 . RNA (Ribonükleik asit) ekstraksiyonu için indüklenmemiş ve indüklenmiş lizojen kültürlerinin hazırlanması
- Lizojenin tek bir kolonisini 5 mL LB'ye inoküle ederek taze bir gece boyu kültür hazırlayın ve 37 °C'de çalkalamalı (180 rpm (dakikadaki devir sayısı)) olarak 18–24 saat inkübe edin.
- Gece boyu kültürü, sekiz adet 250 mL'lik erlene 1:100 oranında 80 mL LB(Lysogeny broth) içinde alt kültüre aktarın.
- İlk erleni “indüklenmemiş” ve diğerlerini, her bir örneğin hasat edileceği zaman noktalarıyla birlikte (örneğin, “indüklenmiş t = 0”, “indüklenmiş t = 10 dk”, “indüklenmiş t = 20 dk” vb.) “indüklenmiş” olarak etiketleyin (Şekil 1).
- 90 dakikalık inkübasyonun ardından, OD (Optik yoğunluk) 600 değeri 0,1–0,2 arasındayken veya minimal spontan indüksiyon zamanında (tartışma bölümüne bakınız), indüklenmemiş erlene 4 µL %1'lik buzlu asetik asit (v/v) ekleyin (Şekil 1).
NOT: Bu çalışmadaki indükleyici ajan çözücü olarak %1'lik buzlu asetik asit kullanılarak hazırlandığından, kontrol adımı olarak aynı miktarda çözücü tek başına eklenmiştir. Farklı indükleyicilerin hazırlanışına bağlı olarak alternatif kontroller değerlendirilebilir. - İndüklenmemiş erlendeki 80 mL kültürü 720 mL steril LB'ye ekleyin ve hemen kültür hacminin %20'si kadar (160 mL) stop çözeltisi (buz gibi soğuk %5 [v/v] fenol, pH 4,3, %95 [v/v] etanol) ekleyerek RNA transkriptlerini stabilize etmek için buz üzerinde minimum 30 dakika ve maksimum 2 saat inkübe edin. Bu, indüklenmemiş örnektir.
- Yedi adet 250 mL'lik erlendeki geri kalan kültürleri (Şekil 1), uygun bir indükleyici ajanın FMIC (Final minimal inhibisyon konsantrasyonu) ile (bu durumda, %1'lik buzlu asetik asit [w/v] içinde hazırlanan 25 mg·mL−1 norfloksasin, 1 µg·mL−1 nihai konsantrasyonda kullanılmıştır) indükleyin, iyice karıştırın ve 37 °C'de 180 rpm çalkalama ile 1 saat inkübe edin.
NOT: Bu adım, lizojen kültürünü daha koordineli bir litik replikasyon durumuna zorlayacaktır. Kültürdeki hücrelerin çoğu, enfeksiyöz faj partiküllerinin litik üretimine girmeye başlayacaktır. - İndüklenmiş erlendeki 80 mL kültürü, indükleyici ajanı etkili bir şekilde seyrelten 720 mL steril LB'ye ekleyerek hücrelerin toparlanmasını sağlayın. Bakteriyel hücreleri, adım 1.5'te belirtildiği gibi stop çözeltisi ekleyerek 0. dakikadan 1. saate kadar her 10 dakikada bir her erlendeki örneklerden hasat edin.
NOT: Stop çözeltisi RNA'yı 2 saate kadar stabilize eder. Ancak, örnek stabilitesini artırmak için sonraki tüm adımları 4 °C'de gerçekleştirin. - RNA degradasyonunu önlemek için, işlem sonrası 2 saati geçmeyecek şekilde mümkün olan en kısa sürede 4 °C'de 10.000 x g'de 15 dakika santrifüj ederek hasat edin.
- Süpernatanı uzaklaştırın ve her bir örneği 1,5 mL'lik mikrofüj tüpüne aktarmadan önce ayarlanabilir otomatik pipet kullanarak bakteriyel peletleri kalan sıvı içinde nazikçe resüspanse edin.
- Mikrofüj tüplerini 4 °C'de bir mikrofüjde yüksek hızda (13.000 x g) 1 dakika santrifüj edin ve kalan süpernatanı uzaklaştırın.
- Kapatılmış her bir mikrofüj tüpünü sıvı azota daldırarak peletleri şok dondurun. Bu, RNA ekstraksiyonu için hücrelerin verimli lizesine yardımcı olacaktır.
- Her donmuş pelete TRIzol (1 mL) ekleyin ve süspansiyonu pipetleyerek homojenize edin (vortekslemeyin). Tüm örnekler için RNA ekstraksiyonu yapılana kadar −80 °C'de saklayın.
NOT: Protokol bu noktada durdurulabilir. - 1.1–1.13 adımlarını üç biyolojik replika ile tekrarlayın.
Sonuçlar
Şekil 1: RNA izolasyonu için indüklenmiş ve indüklenmemiş kültürlerden örnekleme yapılmasına yönelik deneysel tasarım.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| LES fajları | Norfloxacin kullanılarak LESB58'den indüklenmiş ve saflaştırılmıştır. | Bu çalışma | |
| Lizojeni Besiyeri (LB) | Merck | 1.10285.500 | |
| Lizojeni Besiyeri (LB) Agar | Merck | 1.10283.500 | |
| Agar Agar | Fisher | A/1080/53 | |
| Üst Agar | 100 mL suda 0,4 g Agar Agar + 2,5 g LB Besiyeri; otoklavlayın ve kullanın. | - | |
| Rifampisin | Sigma (Stok: Metanol içinde 50 mg/mL - İyi karıştırın, sterilize etmek için 0,22 µm filtre kullanın ve kullanana kadar -20 °C'de saklayın) | R3501 | |
| Glasyal Asetik Asit | Fisher, su içinde %1 (v/v) | 10060000 | |
| Norfloksasin | Sigma (Stok: %1 Glasyal Asetik Asitte 25 mg/mL - İyi karıştırın, sterilize etmek için 0,22 µm filtre kullanın ve kullanana kadar -20 °C'de saklayın; dondurma-çözme döngülerini önlemek için küçük alikotlar halinde saklayın) | N9890 | |
| Sitrat tamponu pH 4,3 ile doyurulmuş fenol | Sigma | P-4682 | |
| Moleküler biyoloji sınıfı etanol | Fisher | 16695992 | |
| TRIzol | Invitrogen | 12044977 | |
| Kloroform | Fisher | 11398187 | |
| İzopropanol | Fisher | 17150576 | |
| Nükleazden arındırılmış su | Invitrogen | 10526945 |
