Transfekte Memeli Hücrelerden Adeno-İlişkili Virüs Hasadı

Özet

Kaynak: Rghei, A. D., et al. Production of Adeno-Associated Virus Vectors in Cell Stacks for Preclinical Studies in Large Animal Models. J. Vis. Exp. (2021)

Bu video, kimyasal lizis ve santrifüjleme kullanılarak transfekte edilmiş memeli hücrelerden ham adeno-ilişkili virüsün geri kazanımını göstermekte olup, downstream saflaştırma ve preklinik gen tedavisi uygulamaları için yüksek verimli AAV üretimine olanak tanımaktadır.

Protokol

1. AAV (adeno-associated virus) hasadı ve transfekte edilmiş HEK293 (insan embriyonik böbrek 293) hücrelerinin kimyasal lizisi

1. Hücre kültür odasını, kopan hücreler nedeniyle ortam bulanık görünene kadar hücrelerin yerinden çıkması için şiddetli bir şekilde sallayın ve dört adet 500 mL santrifüj tüpüne boşaltın.
2. Hücreleri çöktürmek için tüpleri 4 °C'de 30 dk boyunca 18,000 x g'de santrifüjleyin. Berraklaştırılmış süpernatantı 1 L polietilen tereftalat copolyester (PETG) şişeye boşaltın.NOT: Yüksek hızlı bir santrifüje erişim yoksa, 12,000 x g'de 40 dk boyunca santrifüjleyin. Bu hızda çöken hücreler katılaşmamış olabilir ve süpernatant boşaltılırken kayabilir.
3. Hücre peletlerini 500 mL santrifüj tüplerinde 50 mL liziz tamponu ile yeniden süspanse edin ve 37 °C'de 60 dk inkübe edin.
4. Tüpleri 18,000 x g'de 30 dk santrifüjleyin ve ardından süpernatantı aynı 1 L PETG şişeye aktarın. Çöken hücre kalıntılarını atın.NOT: Berraklaştırılmış süpernatantı hemen saflaştırın ve 72 saate kadar 4 °C'de saklayın. Daha uzun süreli saklama için -80 °C'de saklayın. -20 °C'de saklamayın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
10 bölmeli cellstack	Corning	3271
1L PETG şişe	Thermo Fisher Scientific	2019-1000
1000 mg/L D-glukoz ve L-glutamin içeren Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Cytiva Life Sciences	SH30022.01
Fetal Bovine Serum (FBS)	Thermo Fisher Scientific	SH30396.03
HEK293 hücreleri	American Tissue Culture Collection	CRL-1573	Hücreler teslim alındığında, üretici protokolünde açıklandığı şekilde çözdürün ve kültüre edin. Hücreler minimum düzeyde pasajlanıp iyi büyümeye başladığında, gelecekte kullanmak üzere bir alt fraksiyonu alikotlar halinde dondurun ve sıvı azot içerisinde saklayın. Daima pasaj numarası 30'un altındaki hücreleri kullanın. Kültürlenen hücreler 30 kereden fazla pasajlandığında, saklanan alikotlardan yeni bir kültür başlatılması önerilir
Büyük Hacimli Santrifüj Tüp Destek Minderi	Corning	CLS431124	Santrifüj rotoru uygun V-tabanlı minderlere sahip değilse, büyük hacimli santrifüj tüpleriyle birlikte destek minderi kullanılmalıdır
Büyük Hacimli Santrifüj Tüpleri	Corning	CLS431123-6EA	500 mL santrifüj tüpleri