Adeno-İlişkili Virüs Vektörlerinin Afinite Kromatografisi Tabanlı Saflaştırılması

Özet

Kaynak: Rghei, A. D., et al. Production of Adeno-Associated Virus Vectors in Cell Stacks for Preclinical Studies in Large Animal Models. J. Vis. Exp. (2021)

Video, heparin tabanlı bir afinite matrisi kullanılarak ham konak lizatından rekombinant adeno-ilişkili virüs (AAV) vektörlerinin saflaştırılmasını göstermektedir. Viral partiküller immobilize edilmiş heparine bağlanırken, safsızlıklar yıkanarak uzaklaştırılır. Yüksek tuzlu bir tampon, bütünlüğü korunmuş virüsleri serbest bırakır ve bunlar zenginleştirilmiş fraksiyonlar halinde toplanır. Bu fraksiyonlar, membran santrifüjasyonu ile konsantre edilir ve kalıntı partikülleri geri kazanmak için durulanarak saflaştırılmış, yüksek titreli AAV vektörleri üretilir.

Protokol

1. Hücre yığınlarında HEK293 hücrelerinin çift plazmid transfeksiyonu

1. İnsan Embriyonik Böbrek 293 (HEK293) hücrelerinin bulunduğu bir kriyoviyali 37 °C'ye ayarlanmış bir boncuk banyosunda çözdürün.
   NOT: Ekim sırasında soğuk şokunu önlemek için, hücreler çözülürken komple Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)'u 37 °C'ye önceden ısıtın. Optimal büyüme ve transfeksiyon verimliliği sağlamak için hücrelerin pasaj sayısının düşük, ideal olarak 20'den az olduğundan emin olun. Hücrelerin mikoplazma içermediğinin onaylandığından emin olun.
2. Kriyoviyalin içeriğini, 10 mL önceden ısıtılmış komple DMEM içeren 15 mL'lik konik bir tüpe damla damla aktarın ve hücreleri 500 × g'de 5 dk boyunca santrifüjleyin.
3. Besiyerini aspire edin ve ardından HEK293 hücrelerini 20 mL önceden ısıtılmış komple DMEM içinde resüspande edin. Hücreleri 15 cm'lik bir plakaya ekleyin ve 37 °C'de, %5 CO₂ ile inkübe edin.
4. Bir adet 15 cm'lik plaktaki hücreleri, hücre kültürü odasına ekim yapmak üzere üç plağa bölün.
   1. Hücreler %80 konfluensle ulaştığında, besiyerini aspire edin ve monokatmanı bozmamak için plağı 3 mL fosfat tamponlu salin (PBS) ile nazikçe yıkayın. Ardından, PBS'yi aspire edin ve 3 mL tripsin ekleyin.
   2. Hücreler plakadan ayrılana kadar 37 °C'de 2 dk inkübe edin ve ardından plağa 7 mL komple DMEM ekleyerek tripsini nötralize edin.
   3. Tüm besiyerini ve hücreleri 15 mL'lik bir tüpe toplayın ve hücreleri 500 × g'de 5 dk santrifüjleyerek pellete edin.
   4. 15 mL'lik tüpteki süpernatantı aspire edin ve hücre pelletini 3 mL komple DMEM içinde resüspande edin. 20 mL komple DMEM içeren her bir 15 cm'lik plağa 1 mL ekleyin; hücrelerin eşit dağılması için plakaları nazikçe sallayın ve 37 °C'de, %5 CO₂ ile inkübe edin.
5. Hücreler %80 konfluensle ulaştığında, 1.4.1 ve 1.4.2 adımlarını tekrarlayın. Süpernatantı 50 mL'lik konik tüplere toplayın ve hücrelerin homojen olduğundan emin olmak için tüpü nazikçe ters çevirin.
6. Hücre örneklerinin 10 µL'sini 10 µL trypan blue ile karıştırıp karışımı bir hücre sayım lamına ekleyerek hücre sayıcıda analiz edin ve hücre yoğunluğunu belirleyin.
7. Hücre kültürü odasını (6360 cm² yüzey alanı) 1 × 10⁴ hücre/cm² yoğunlukta ekmek için, 1 L önceden ısıtılmış komple DMEM'i gerekli hücre süspansiyonu ile karıştırın. Hücre karışımını hücre kültürü odasına boşaltın, hücrelerin her monokatman boyunca eşit dağılması için nazikçe döndürün (Şekil 1) ve 37 °C'de, %5 CO₂ ile inkübe edin.
8. Hücre kültürü odasına ek olarak, konfluens referansı olarak 15 cm'lik bir plakayı 1 × 10⁴ hücre/cm² yoğunlukta ekleyin.
9. Yaklaşık 65 saatlik inkübasyonun ardından, referans plağın konfluensini kontrol edin; ideal olarak ~%80-90 konfluensle ulaşmış olmalıdır.
   NOT: Hücre kültürü odasına eklemek için komple DMEM'i 37 °C'de önceden ısıtın.
10. Polietilenimin (PEI)/DNA karışımını 3:1 (a/a) konsantrasyon oranında hazırlayın.
    1. pHelper:pTrangene oranını 3:1 yapmak için 40 mL serumu azaltılmış besiyerine 475 µg pTrangene ve 1425 µg pHelper ekleyerek DNA karışımını 50 mL'lik konik bir tüpte hazırlayın.
       NOT: PEI/DNA karışım hesaplayıcısı Tablo 1 kullanılarak bulunabilir.

Hücre Kültür Odacığının Transfeksiyonu
Protokol
1. Transfeksiyon öncesinde DNA, OptiMEM ve PEI'nin oda sıcaklığına gelmesini bekleyin
2. Transfekte edilecek hücre yığını sayısını girin (fazlalık eklenmesine gerek yoktur)
3. Gerekli hacimleri değiştireceği için DNA konsantrasyonlarının doğru olduğundan emin olun
Hücre Kültürü Odacıklarının Sayısı		1
Transgen plazmidinin konsantrasyonu		1	mg/mL
pDGM6.2FF plazmidinin konsantrasyonu		1	mg/mL
		Hücre kültürü odaları başına miktar		Transfeksiyon Mastermiksi
	OptiMEM	48.1	mL	48.1	mL
1:3 pTransgen:pHelper oranı	pTransgen	475	µg	475	µL
	pHelper	1425	µg	1425	µL
4. Gerekli hacimlerde OptiMEM ve plazmid DNA'yı 50 mL'lik konik tüpe ekleyin
5. Karıştırmak için 10 kez altüst edin
3:1 PEI:DNA oranı	PEI Max	5.7	mL	5.7	mL
6. OptiMEM ve plazmid DNA içeren 50 mL'lik tüpe gerekli miktarda PEI ekleyin
7. 50 mL'lik tüpü hemen kapatın ve karıştırmak için 3-5 kez vorteksleyip ters çevirin.
8. PEI komplekslerinin inkübasyonu için 10 dakikaya zamanlayıcıyı ayarlayın
9. Transfekte edilecek hücre istiflerini Biyolojik Güvenlik Kabinine (BSC) taşıyın
10. 10 dakika sonra, transfeksiyon karışımını bir turuncu porttan içeri dökün.
11. Sıvıyı hücre yığınının tamamına yayılacak şekilde nazikçe karıştırın
12. Transfekte edilen hücre yığınının her katmanında eşit hacim olduğundan emin olarak hücre yığınını inkübatöre geri yerleştirin
13. Hücre kültür odasını 72 saat sonra hasat edin

Tablo 1: Hücre kültürü odası için transfeksiyon hesaplayıcı. Hücre kültürü odası transfeksiyonu için pTransgene, pHelper ve PEI'nin doğru konsantrasyonlarını belirlemeye yönelik etkileşimli çalışma sayfası.

2. Azaltılmış serumlu besiyerine ve DNA karışımına 5.7 mL PEI (1 g/L) damla damla ekleyin. Ardından, kısa süreli vorteksleyin ve oda sıcaklığında 10 dk inkübe edin.
NOT: PEI/DNA oda sıcaklığında inkübe edilirken hafifçe bulanıklaşacaktır.

11. 8 dakikalık PEI/DNA inkübasyonunun ardından, hücre kültürü haznesindeki medyumu uzaklaştırın.
    NOT: Hücrelerin yerinden oynamasını önlemek için medyumun sorunsuz akışını sağlamak amacıyla her iki turuncu kapağın da gevşetildiğinden emin olun.
12. PEI/DNA'yı 1 L önceden ısıtılmış tamamlayıcı DMEM'e ekleyin ve karışımı yavaşça hücre kültürü haznesi portuna boşaltın. Sıvıyı tüm sıralara eşit şekilde dağıtın (Şekil 1) ve %5 CO₂ içeren 37 °C'de 72 saat boyunca inkübe edin.

2 Adeno-ilişkili virüs (AAV) hasadı ve transfekte edilmiş HEK293 hücrelerinin kimyasal lizisi

1. Hücre kültür odasını, kopan hücreler nedeniyle besiyeri bulanık görünene kadar kuvvetlice çalkalayarak hücreleri yerinden ayırın ve dört adet 500 mL santrifüj tüpüne boşaltın.
2. Hücreleri çöktürmek için tüpleri 4 °C'de 30 dk boyunca 18,000 × g hızında santrifüjleyin. Berraklaşmış süpernatantı 1 L polietilen tereftalat kopolimer (PETG) şişeye boşaltın.
   NOT: Yüksek hızlı bir santrifüje erişim yoksa, 12,000 × g hızında 40 dk santrifüjleyin. Bu hızda çöken hücreler katılaşmamış olabilir ve süpernatant boşaltılırken kayabilirler.
3. Hücre peletlerini 500 mL santrifüj tüpleri içinde 50 mL lizis tamponu ile yeniden süspande edin ve 37 °C'de 60 dk inkübe edin.
4. Tüpleri 18,000 × g hızında 30 dk santrifüjleyin ve ardından süpernatantı aynı 1 L PETG şişeye aktarın. Çöken hücre kalıntılarını atın.
   NOT: Berraklaşmış süpernatantı hemen saflaştırın veya 4 °C'de en fazla 72 saまで saklayın. Daha uzun süreli saklama için -80 °C'de muhafaza edin. -20 °C'de saklamayın.

3 Heparin afinite kromatografisi kullanılarak AAV vektör saflaştırma

1. Ham lizatı -80 °C'den çıkarın ve çözünmesi için gece boyunca 4 °C'de bekletin. Çözündükten sonra, ham lizatı filtrelemek için 0.22 µM filtre kullanın.
2. Santrifüj konsantratörünü pasivize etmek için, kullanılan her bir heparin sefaroz kolonu için santrifüj konsantratörüne 4 mL filtre ön işlem tamponu ekleyin. Santrifüj konsantratörünü oda sıcaklığında 2-8 saat pasivize edin. Pasivizasyonu, saflaştırma basamaklarından hemen önce hazırlayın.
3. Tüpleri ve pompayı kurun (Şekil 2).
   1. Tüpleri peristaltik bir pompaya yerleştirin ve 20 mL 1 M NaOH geçirin. Ardından, 50 mL moleküler düzeyde su ve sonrasında 50 mL bazal DMEM geçirin.
   2. 5 mL heparin sefaroz kolonunu tüplere bağlayın ve koruyucuyu uzaklaştırmak için 25 mL bazal DMEM geçirin.
4. Filtrelenmiş ham lizatın 0.2 µM'sini 1-2 damla/s akış hızında kolondan geçirin.

NOT: Kolonun kurumasına izin vermediğinizden ve hava kabarcığı oluşturmadığınızdan emin olun; aksi takdirde kolon zarar görecek ve AAV elüsyonu engellenecektir. Kolon kurumuşsa onu atın ve ham lizatın geri kalanı için yeni bir kolon kullanın.

5. Tüm ham lizatı heparin kolonuna yükleyin ve kolonu yıkamak için aşağıdaki çözeltileri kullanın.
   1. Mg²⁺ ve Ca²⁺ içermeyen 50 mL 1× Hank's Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) ile yıkayın.
   2. Mg²⁺ ve Ca²⁺ içermeyen HBSS içinde %0,5 N-Lauroylsarcosine ile 15 mL yıkayın.
   3. Mg²⁺ ve Ca²⁺ içermeyen 50 mL HBSS ile yıkayın.
   4. Mg²⁺ ve Ca²⁺ içeren 50 mL HBSS ile yıkayın.
   5. Mg²⁺ ve Ca²⁺ içeren 50 mL 200 mM NaCl/HBSS ile yıkayın.
   6. Mg²⁺ ve Ca²⁺ içeren 300 mM NaCl/HBSS ile 5 × 5 mL (toplam 25 mL) elüsyon yapın ve elüsyonları E1-E5 olarak etiketleyin (her elüsyon 5 mL'dir).
6. Virüsün santrifüj konsantratörü kullanılarak konsantre edilmesi
   1. Ön işlem tamponu içeren santrifüj konsantratörünü 900 × g'de 2 dk boyunca döndürün. Akış sıvısını atın.
   2. Santrifüj konsantratörü filtresini Mg²⁺ ve Ca²⁺ içeren 4 mL HBSS ile yıkayın ve 1000 × g'de 2 dk boyunca santrifüjleyin; akış sıvısını atın.
   3. E2 elüsyonunu santrifüj konsantratörüne ekleyin. 1000 × g'de 5 dk döndürün ve akış sıvısını atın.
   4. E2 ekleme işlemini tamamlayın, ardından E3'ü santrifüj konsantratörüne ekleyin ve konsantre virüs yaklaşık 1 mL olana kadar 1000 × g'de 5 dk döndürün.
      NOT: Vektörü, hacim filtre seviyesinin altına düşecek şekilde santrifüjlemekten kaçının. E1, E4 veya E5 fraksiyonları çok az vektör içerdiği veya hiç içermediği ve kontaminanlar barındırdığı için bunları santrifüj konsantratöründe konsantre etmeyin.
   5. Konsantre virüsü p200 filtreli uç kullanarak santrifüj konsantratöründen alın ve steril 1,5 mL santrifüj tüpüne yerleştirin.
   6. Filtrede kalan AAV'leri yerinden oynatmak için santrifüj konsantratörünü Mg²⁺ ve Ca²⁺ içeren 200 µL HBSS ile durulayın. Membrana yapışmış olan virüsleri sökmek için pipetle defalarca kuvvetlice çekip bırakın (yaklaşık 30 sn boyunca) ve bunları virüsün geri kalanıyla birlikte 1,5 mL santrifüj tüpüne aktarın. Tüpü iyice karıştırın.
   7. DNA ekstraksiyonu için 5 µL alikot alın ve saflaştırılmış vektörü -80 °C'de saklayın.
7. Kolonu 25 mL 2 M NaCl kullanarak yıkayın. Ayrıca, kolonu yıkamak için 37 °C'ye önceden ısıtılmış 25 mL %0,1 Triton X-100 kullanın. Ardından, kolonu 50 mL steril dH₂O ile yıkayın ve sonra 25 mL %20 etanol ile yıkayın.
8. Saklama çözeltisi olduğu için kolon membranının %20 etanol ile tamamen doyurulduğundan emin olun. Kolonu sağlanan tıpalarla kapatın ve 4 °C'de saklayın.
9. Tüpleri 1 M NaOH içinde saklayın.
   NOT: Doğru şekilde temizlendikleri takdirde, heparin sefaroz kolonlar beş sefereye kadar yeniden kullanılabilir.

Sonuçlar

Şekil 1: Hücre ekimi ve transfeksiyonu için hücre istifinin yönlendirilmesi. Hücre istifine ekim yapmak için, havalandırma kapaklarından birini çıkararak başlayın ve gerekli miktardaki HEK293 hücrelerini içeren 1 L önceden ısıtılmış tamamlayıcı Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) dökün (A). Her iki havalandırma kapağını sıkarak hücreleri ve medyayı eşit şekilde dağıtın; ardından havalandırma kapaklarından birini kullanarak tüm medyayı hücre istifinin köşesine getirin ve istifi o köşeye yerleştirin (B), hücre istifini yan tarafına yatırın (C) ve ardından havalandırma portları yukarı bakacak şekilde hücre istifini 90° döndürün (D) (E). Hücre istifini nazikçe normal yatay konumuna indirin ve hücre istifinin tüm odacıklarının tamamen medya ile kaplandığından emin olun (F). Transfeksiyon yaparken, hücre monokatmanını bozmamak adına akışın düzenli olması için her iki havalandırma kapağını sökün ve eski medyayı yavaşça steril bir atık kabına boşaltın (G).

Şekil 2: Adeno-ilişkili virüs (AAV) saflaştırması için peristaltik pompa kurulumu. Boruları ham lizattan geçirerek, peristaltik pompa üzerinden heparin matriks kolonuna yönlendirin.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
0.22 μm Filtre	Millipore Sigma	S2GPU05RE
0.25% Trypsin	Fisher Scientific	SM2001C
10 Kameralı hücre yığını (cellstack)	Corning	3271
1L PETG şişe	Thermo Fisher Scientific	2019-1000
Hücre Kültürü Kapları	Greiner bio-one	7000232	15 cm plaklar
Kültür Konik Tüpü	Thermo Fisher Scientific	339650	15 mL konik tüp
Kültür Konik Tüpü	Fisher Scientific	14955240	50 mL konik tüp
1000 mg/L D-glukoz, L-glutamin içeren Dulbecco Modifiyeli Eagle Besiyeri (DMEM)	Cytiva Life Sciences	SH30022.01
Etanol	Greenfield	P016EA95	Bölüm 3.7.4 için etil alkolü (%95 hacim) %20'ye seyreltebilirsiniz
Fetal Bovin Serum (FBS)	Thermo Fisher Scientific	SH30396.03
Mg²⁺ ve Ca²⁺ içeren Hank Dengeli Tuz Çözeltileri (HBSS)	Thermo Fisher Scientific	SH302268.02
Mg²⁺ ve Ca²⁺ içermeyen Hank Dengeli Tuz Çözeltileri (HBSS)	Thermo Fisher Scientific	SH30588.02
HEK293 hücreleri	American Tissue Culture Collection	CRL-1573	Hücreler teslim alındıktan sonra, üreticinin protokolünde açıklandığı şekilde çözdürün ve kültüre edin. Hücreler minimum düzeyde pasajlandığında ve iyi büyüdükten sonra, gelecekteki kullanımlar için bir alt fraksiyonu alikotlar halinde dondurup sıvı azot içinde saklayın. Daima 30. pasaj numarasının altındaki hücreleri kullanın. Kültür hücreleri 30 kereden fazla pasajlandığında, saklanan alikotlardan yeni bir kültür başlatılması önerilir
Heparin sülfat kolonu	Cytiva Life Sciences	17040703
Yüksek Hacimli Santrifüj Tüpü Destek Minderi	Corning	CLS431124	Santrifüj rotoru uygun V-taban minderlerine sahip değilse, yüksek hacimli santrifüj tüpleriyle birlikte destek minderi kullanılmalıdır
Yüksek Hacimli Santrifüj Tüpleri	Corning	CLS431123-6EA	500 mL santrifüj tüpleri
Mikrosantrifüj tüpü	Fisher Scientific	05-408-129	1.5 mL mikrosantrifüj tüpü, kullanmadan önce sterilize edin
Moleküler Sınıf Su	Cytiva Life Sciences	SH30538.03
N-Lauroilsarkozin sodyum tuzu	Sigma Aldrich	L5125	DİKKAT. Eldiven kullanın
NaCl	Thermo Fisher Scientific	BP35810
Optimem, düşük serumlu besiyeri	Thermo Fisher Scientific	31985070
Pasteur pipetleri	Fisher Scientific	13-678-20D	Kullanmadan önce sterilize edin
Fosfat tamponlu salin (10x)	Thermo Fisher Scientific	70011044	Hücrelerde kullanmak için 1x'e seyreltebilirsiniz
Penisilin-Streptomisin Çözeltisi	Cytiva Life Sciences	SV30010
pHelper plazmidi	De novo tasarım veya plazmid deposundan temin edilmiş	NA
Pipet haznesi	Thermo Fisher Scientific	13-681-502	Steril pipet hazneleri satın alın
Polietilen glikol tert-oktilfenil eter (Triton X-100)	Thermo Fisher Scientific	9002-93-1	DİKKAT. Eldiven kullanın
Polietilenimin (PEI)	Polyscience	24765-1	1L çözelti hazırlamak için üreticinin talimatlarını izleyin. 0.22μm filtreyle süzün ve 4°C'de saklayın
pTrangene plazmidi	De novo tasarım veya plazmid deposundan temin edilmiş	NA	Bölüm 5.0'daki AAV titrasyonu ile uyumlu olması için genomda SV40 polyA içermelidir
Pompa hortumu	Cole-Parmer	RK-96440-14	Hortum uzunluğunu ve E1-E5 fraksiyonlarındaki virüs muhafazasını optimize edin
Sodyum hidroksit (NaOH)	Thermo Fisher Scientific	SS266-4
Tripan mavisi	Bio-Rad	1450021