Sıçan Fertilize Embriyolarının Lentiviral Vektör Tabanlı Transdüksiyonu

Özet

Kaynak: Koza, P., et al. Generation of Transgenic Rats using a Lentiviral Vector Approach. J. Vis. Exp. (2020)

Bu video, transgenik sıçanların üretimi için stabil transgen entegrasyonu sağlamak amacıyla, döllenmiş sıçan embriyolarına lentiviral vektörlerin mikroenjeksiyon yardımıyla iletilmesini göstermektedir.

Protokol

Hayvan örneklerini içeren tüm prosedürler, ilgili hayvan etik kurulunca incelenmiş ve onaylanmıştır.

1. Zona pellucida altına, tek hücre evresindeki embriyoya lentiviral vektörlerin mikroenjeksiyonu
   NOT: Mikroenjeksiyon için iki görünür pronükleusu olan tek hücre evresindeki embriyoları kullanın (Şekil 1).
   1. Lentivirüs (LV) alikotunu oda sıcaklığında çözün ve kalan hücresel döküntüleri çöktürmek için 10,0 x g'de ve oda sıcaklığında (RT) 2 dk santrifüj edin.
   2. Mikroenjeksiyon düzeneği
      1. Bir mikroforge kullanarak cam tutma pipetlerini (borosilikat cam kapiler) hazırlayın. 5–10 cm'lik bir uç oluşturmak için cam kapileri bir alev üzerinde çekin. Pipeti ~4 cm'lik bir uç bırakacak şekilde kırın. Dış çap ~80–120 µm olmalıdır.
         NOT: Pipet ucunun tamamen düz ve pürüzsüz olduğundan emin olun.
      2. Çekilen pipeti, ucu ısıtma filamentinin önünde olacak şekilde bir mikroforge'a yerleştirin. Filamenti pipet ucuna çok yakın bir konumda ısıtın ve çapı ~15 µm'ye (embriyo boyutunun yaklaşık %20'si) küçülmesini sağlayın. Pipeti ısıtma filamentine dik olarak, pipet ucundan 2–3 mm uzağa konumlandırın ve ısıtmaya başlayın. Cam yumuşayacaktır. 15° açılı bir hale gelene kadar ısıtın.
      3. Bir pipet çekicisi kullanarak filamentli mikroenjeksiyon borosilikat cam kapilerleri hazırlayın. Kapileri çekme haznesine yerleştirin. Bir ramp testi gerçekleştirin (yeni camlar için ilk seferde ve filament değişiminden sonra her seferinde). Isıyı (Heat) ramp değerinin -10'una, Çekmeyi (Pull) 100'e, Hızı (Velocity) 150'ye ve Süreyi (Time) 10'e ayarlayın.
         NOT: Optimal bir enjeksiyon kapileri elde etmek için parametreleri modifiye edin.
      4. Biyogüvenlik laminer akış kabini altında, bir mikroloader ucuyla mikroenjeksiyon pipetine yaklaşık 2 µL viral solüsyon yükleyin.
      5. Bir mikroenjeksiyon kabı (60 mm Petri kabı kapağı) hazırlayın; ortasına 10 µL M2 medyumu damlası ekleyin ve üzerini sıvı parafin veya mineral yağ ile kapatın.
      6. Tutma pipetini ve viral solüsyon yüklü mikroenjeksiyon kapilerini, bir ters mikroskop altında mikromanipülatöre ve mikroenjeksiyon kabına monte edin.
   3. Mikroenjeksiyonu gerçekleştirin
      1. 15–20 tek hücre evresindeki embriyoyu mikroenjeksiyon kabındaki M2 damlasına transfer edin. Embriyoyu bir tutma pipeti kullanarak tutun.
      2. 40x büyütme kullanarak, otomatik bir enjektöre bağlı olan cam kapiler yardımıyla LV solüsyonunu zona pellucida altına, perivitelin boşluğa enjekte edin. Kapileri bir an için zona pellucida altında tutun.
         NOT: Hafif pozitif basınç uygulandığında viral solüsyon enjeksiyon kapilerinden sürekli olarak akacaktır, ancak iletilen süspansiyon hacmi kontrol edilemez.
      3. İnce bir pipet kullanarak embriyoları 37 °C'de ve %5 CO₂ atmosferindeki inkübatörde bulunan kültür kabına geri aktarın. Tek bir zigota yapılan enjeksiyon sayısı değişkenlik gösterebilir ve viral vektör konsantrasyonuna göre uyarlanabilir.
         NOT: Enjekte edilen embriyolar tek hücre evresinde taşıyıcı annelere aktarılabilir veya iki hücre evresinde aktarılmadan önce M16 medyumunda gece boyu (O/N) inkübe edilebilir. Sıçan embriyolarının uzun süreli in vitro kültüründen kaçınılmalıdır.

Sonuçlar

Şekil 1. Subzonal lentiviral vektör injeksiyonu için hazırlanan tek hücreli evredeki sıçan embriyosunun mikroskobik fotoğrafı. Embriyo, bir tutma pipeti ile sabitlenmiştir. Maternal ve paternal genetik materyalleri içeren iki pronükleus ve polar cisim görülmektedir. Ölçek çubuğu = 20 μm.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Kalibre edilmiş mikrokapiler pipetler için aspiratör tüp düzenekleri	Sigma	A517-5EA
Filamanlı borosilikat cam kapilerler GC10TF-15	Harvard Apparatus Limited	30-039	Enjeksiyon kapileri
CELLSTAR Doku Hücre Kültür Kabı 35-mm	Greiner Bio-One	627160
CELLSTAR Doku Hücre Kültür Kabı 60-mm	Greiner Bio-One	628160
Mineral Yağı	Sigma	M8410-50ML
İnverted Mikroskop	Zeiss	Axiovert 20
M2 besiyeri	Sigma	M7167
VacuTip	Eppendorf	5175108	Tutucu kapiler
M16 besiyeri EmbryoMax	Sigma	MR-016-D