Afinite Kromatografisi Kullanılarak Viral İntegrazın Saflaştırılması

Özet

Kaynak: Lopez Jr., M. A., et al. Detection and Removal of Nuclease Contamination During Purification of Recombinant Prototype Foamy Virus Integrase. J. Vis. Exp. (2017)

Bu video, nikel afinite kromatografisi kullanılarak polihistidin etiketli viral integrazın saflaştırılmasını göstermektedir. Protokol, integrazı nikel yüklü reçineye olan afinitesine göre seçici olarak izole etmek için imidazol gradyan elüsyonu kullanır.

Protokol

1. Nikel Afinite Kromatografisi

1. Bir bakteriyel peleti buz üzerinde çözdürün.
   NOT: Bu işlem önemli miktarda zaman alacaktır (yaklaşık 2 - 3 sa). Pelet bir hücre süspansiyonu haline gelene kadar çözüldüğünde, ek olarak 500 μM Fenilmetansülfonil Florür (PMSF) (100 mM stok çözelti) ekleyin.
2. 50 mL'lik bakteri süspansiyonu tüpünü buz üzerinde tutun. 0,5 inç çaplı biyolojik hornu, 0,125 inç çaplı konik mikro ucu, 20 kHz frekansı ve 400 W maksimum gücü olan bir sonikatör kullanarak, 1 L kültürden elde edilen pelet başına bakterileri %30 amplitütta 30 saniye boyunca sonikasyona tabi tutun (1 s açık, 1 s kapalı).
3. Hücre örneğini soğuk bir ultra santrifüj tüpüne aktarın. Tip 60 Ti sabit açılı rotor ile uyumlu polikarbonat şişe düzenekleri (25 mm çap, 89 mm yükseklik) kullanın. Aynı yerçekimi kuvveti elde edilebildiği sürece alternatif tüpler ve rotorlar kullanılabilir. 4 °C'de 60 dk boyunca 120.000 x g'de santrifüjleyin. Belirgin bir pelet oluşmuş olmalıdır. Süpernatan sarı renkte olabilir.
4. Süpernatanı dökerek veya pipetleyerek soğuk bir 50 mL'lik konik tüpe aktarın. Hacmi not edin; bu hacim yaklaşık olarak şok dondurma öncesinde kullanılan resüspansiyon tamponu hacmiyle aynı olmalıdır. Süpernatan viskozsa, kromatografi kolonunu tıkayabilecek bakteriyel DNA ile kontamine olmuş olabilir. Bu durumda, bakteriyel DNA'yı çöktürmek için ultra santrifüjleme işlemini tekrarlayın.
5. 500 mL Tampon A (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 500 mM NaCl, 500 μM PMSF) ve 500 mL Tampon B (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 500 mM NaCl, 500 μM PMSF, 200 mM imidazol) hazırlayın.
   NOT: Bu protokolde, hızlı protein sıvı kromatografisi (FPLC) sistemini, tüm tamponları ve örneği soğuk odada 4 °C'de tutun.
   1. Tampon A ve B'yi 0,2 μm'lik tek kullanımlık filtre üniteleriyle steril filtreleyin. FPLC sistemine bağlı olarak, pompa A ve pompa B'yi sırasıyla Tampon A ve Tampon B ile yıkayın. İletkenlik ve ultraviyole (UV) okumaları stabilize olana kadar sistemden %90 Tampon A ve %10 Tampon B akıtın. Maksimum akış hızı cihaza bağlı olacaktır; 1,0 MPa maksimum basınç sınırı ile 5 mL/dk akış hızı kullanın.
6. 1,5 mL nikel yüklü rezin (maksimum bağlanma kapasitesi 50 mg/mL, maksimum basınç 1 MPa) ile 110 mm uzunluğunda, 5 mm çapında bir FPLC kolonu hazırlayın. Kolon, saflaştırmadan bir gün önce hazırlanabilir ve 4 ˚C'de saklanabilir.
7. Kolonu FPLC cihazına bağlayın. Kolonu, 0,5 MPa maksimum basınç sınırı ile 0,5 mL/dk akış hızında 20 mL %90 Tampon A ve %10 Tampon B (20 mM imidazol) ile dengeleyin. Cihaz, iletkenlik ve 280 nm'deki UV absorbansı (A₂₈₀) için gerçek zamanlı verileri toplamalıdır. İletkenlik ve UV okumaları stabilize olmalıdır. Bu okumalar stabilize olmadıysa, stabilize olana kadar kolondan tampon akıtmaya devam edin.
8. Protein örneğini (~10 mL pelet başına), 0,5 MPa maksimum basınç sınırı ile 0,15 mL/dk akış hızında kolona yükleyin. Akış hızı ve kolon basıncı saflaştırma boyunca aynı kalır. Akış sonrası sıvıyı (flow through) 50 mL'lik bir tüpe toplayın.
   1. Kolonu 20 mL %90 Tampon A ve %10 Tampon B ile yıkayın. Yıkama sıvısını 50 mL'lik bir tüpe toplayın. Proteinleri, %10'dan %100'e doğru giden 20 mL'lik bir lineer Tampon B gradyeni (20 mM ile 200 mM imidazol arası) ile elüye edin.
   2. Son olarak, kolonu 5 mL %100 Tampon B (200 mM imidazol) ile yıkayın. Gradyen ve son yıkama sıvılarını 0,27 mL'lik fraksiyonlar halinde toplayın.
9. 15 μL 2x SDS-PAGE örnek tamponunu; akış sonrası sıvı, yıkama ve pik A₂₈₀ fraksiyonlarının 15 μL'si ile birleştirin. Örnekleri 3 dk boyunca kaynatın.
   1. İki adet %10'luk SDS-PAGE jeli hazırlayın. Her örnekten 10 μL'yi jellere ve 4 μL önceden boyanmış protein standartlarını yükleyin. Jelleri yürütün, boyayın ve analiz edin.
   2. Görsel incelemeye dayanarak, neredeyse saf prototip köpüklü virüs integraz (PFV IN) içerdiği görülen fraksiyonları birleştirin. Hacmi pipetleyerek ölçün, tipik olarak 8 - 10 mL'dir.
   3. Bir spektrofotometre kullanarak, birleştirilen fraksiyonların A₂₈₀ değerini ölçün ve toplam PFV IN protein miktarını hesaplayın; tipik verim, indüklenmiş kültürün litresi başına ~10 mg'dır. Hekzahistidin etiketli PFV IN'in sönümleme katsayısı 59360 cm^-1 M^-1'dir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
BL21/DE3 Rosetta E. coli	EMD Millipore	70956-4
İmidazol	Sigma-Aldrich	I0250
Ni-NTA Superflow	Qiagen	30430