Bu video, viral integrazın bakteriyel nükleaz kontaminasyonundan heparin Sepharose kolon kromatografisi kullanılarak saflaştırılması prosedürünü ve protein saflığını doğrulamak için ardından yapılan SDS-PAGE analizini göstermektedir.
Yöntem makalesi
Heparin Afinite Kromatografisi ile Viral İntegrazın Saflaştırılması
34 görüntülenme
⸱
30 Eylül 2026
Bu makalede
Özet
Protokol
- Heparin afinite kromatografisi
- 250 mL Tampon C (50 mM tris(hidroksimetil)aminometan hidroklorür (Tris-HCl), pH 7.5, 10 mM ditiotreitol (DTT), 0.1 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA), 500 μM fenilmetilsülfonil florür (PMSF)) ve 250 mL Tampon D (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 10 mM DTT, 0.1 mM EDTA, 500 μM PMSF, 1 M NaCl) hazırlayın.
NOT: Bu protokolde, hızlı protein sıvı kromatografisi (FPLC) sistemi, tamponlar ve numune 4 ˚C sıcaklıktaki soğuk odada tutulur.- Tampon C ve D'yi 0.2 μm tek kullanımlık filtre üniteleriyle steril filtreleyin. FPLC sistemine bağlı olarak, pompa A'yı Tampon C ile ve pompa B'yi Tampon D ile yıkayın. İletkenlik ve ultraviyole (UV) okumaları stabilize olana kadar sistemden %80 Tampon C ve %20 Tampon D akıtın. Maksimum akış hızı cihaza bağlı olacaktır; biz rutin olarak 1.0 MPa maksimum basınç limiti ile 5 mL/min akış hızı kullanıyoruz.
- 1 mL heparin Sepharose reçinesi (mL reçine başına maksimum bağlanma kapasitesi 2.0 mg sığır antitrombin III; maksimum basınç 1.4 MPa) kullanarak 80 mm uzunluğunda ve 5 mm çapında bir FPLC kolonu hazırlayın. Kolon, saflaştırmadan bir gün önce hazırlanabilir ve 4 °C'de saklanabilir. Kolonu FPLC cihazına bağlayın.
- Kolonu, 1 MPa maksimum basınç limiti ve 0.5 mL/min akış hızında 20 mL %80 Tampon C ve %20 Tampon D (200 mM NaCl) ile dengeleyin. Cihaz; iletkenlik ve 280 nm'deki (A280) UV absorbansı hakkında gerçek zamanlı veri toplamalıdır. İletkenlik ve UV okumaları stabilize olmalıdır. Bu okumalar stabilize olmadıysa, stabil hale gelene kadar kolon üzerinden tampon akıtmaya devam edin.
- Prototip köpüklü virüs integraz (PFV IN) numunesinin NaCl konsantrasyonunu, 1.5 hacim Tampon C ekleyerek 200 mM'e düşürün. Örneğin, 10 mL PFV IN'e 15 mL Tampon C ekleyin. Toplam hacmimiz tipik olarak ~25 mL'dir.
- Seyreltilmiş PFV IN numunesini 1.0 MPa maksimum basınç limiti ve 0.5 mL/min akış hızında heparin Sepharose kolonuna yükleyin. Akış hızı ve kolon basıncı saflaştırma boyunca aynı kalır. Akışı (flow-through) 50 mL'lik konik bir tüpe toplayın.
- Kolonu 20 mL %80 Tampon C ve %20 Tampon D (200 mM NaCl) ile yıkayın ve yıkama sıvısını 50 mL'lik konik bir tüpe toplayın. Kolonu %20'den %100'e kadar Tampon D (200 mM'den 1 M NaCl'e) içeren 30 mL'lik lineer bir gradyanla elüe edin.
- Kolonu 5 mL %100 Tampon D ile yıkayın. Gradyanı ve son yıkamayı 0.37 mL'lik fraksiyonlar halinde toplayın.
- Yükleme, akış, yıkama ve fraksiyonları %8 sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) ile analiz edin. PFV IN, heksahistidin etiketinin kesilmesinin ardından 44,394 Da moleküler ağırlığa sahiptir ve heksahistidin etiketi olmadan sönümleme katsayısı 59,360 cm-1 M-1 olarak kalır. Tüm fraksiyonları nükleaz analizi tamamlanana kadar 4 ˚C'de saklayın.
- 250 mL Tampon C (50 mM tris(hidroksimetil)aminometan hidroklorür (Tris-HCl), pH 7.5, 10 mM ditiotreitol (DTT), 0.1 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA), 500 μM fenilmetilsülfonil florür (PMSF)) ve 250 mL Tampon D (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 10 mM DTT, 0.1 mM EDTA, 500 μM PMSF, 1 M NaCl) hazırlayın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| IPTG (İzopropil β-D-1-tiyogalaktopiranozid) | Denville Scientific | CI8280 | |
| Tris Ultra Pure | Gojira Fine Chemicals | UTS1003 | |
| NaCl | P212121 | RP-S23020 | |
| PMSF (Fenilmetilsülfonil florür) | Amresco | 754 | |
| DTT (Ditiotreitol) | P212121 | SV-DTT | |
| UltraPure EDTA | Invitrogen/Gibco | 15575 | |
| Heparin Sepharose 6 Fast Flow | GE Healthcare Life Sciences | 17-0998-01 |
