Bu video, koronavirüs psödovirüs partikülleri kullanılarak yapılan virüs plak analizini açıklamaktadır. Seyreltilmiş psödovirüs, memeli hücre tek tabakasına eklenir ve ardından metilselüloz overlay ile inkübasyona bırakılır. Enfekte hücrelerin oluşturduğu plaklar, enfeksiyöz virüs titresini belirlemek için görsel olarak sayılır.
Yöntem makalesi
Plak Deneyi ile Psödovirüs Partiküllerinin Kantifikasyonu
22 görüntülenme
⸱
30 Eylül 2026
Bu makalede
Özet
Protokol
Koronavirüs spike proteini ve geliştirilmiş yeşil floresan protein (VSV-S-eGFP) eksprese eden veziküler stomatit virüsü psödovirüsünün titrasyonu
1. Viral titrenin belirlenmesi için seri dilüsyon
1. Vero E6 hücrelerini, Dulbecco's Modified Eagle Medium veya DMEM ( %10 FBS (Fetal Bovine Serum) içeren) içerisinde, kuyuk başına 6 × 105 hücre ekim yoğunluğunda 6 kuyucuklu plakalara ekleyin ve 37 °C'de %5 CO₂ ile gece boyunca inkübe edin.
NOT: TMPRSS2 ve hACE2'yi aşırı eksprese eden Vero hücreleri de kullanılabilir.
2. Yedi mikrocentrifüj tüpüne 900 μL besiyeri koyarak, soğuk serumsuz DMEM içerisinde VSV-SeGFP virüsünün 10 katlık seri dilüsyon serisini hazırlayın. Tüpleri 1'den 7'ye kadar etiketleyin. İlk tüpe 100 μL viral stok ekleyin ve kısa süre vorteksleyin. Tüp 1'den tüp 2'ye 100 μL dilüe edilmiş virüs aktarın ve kısa süre vorteksleyin; tüp 7'ye kadar bu işlemi tekrarlayın.
3. Vero E6 hücreleri içeren 6 kuyucuklu plakadaki tüm kuyucuklardaki besiyerini aspire edin ve bunları 105 ile 107 arasındaki dilüsyonların 500 μL'si ile değiştirin. Plakaları 37 °C'de %5 CO₂ ile 45 dk boyunca, her 15 dk'da bir nazikçe sallayarak inkübe edin.
4. İnokülümü aspire edin ve yerine 2x DMEM ile %6 karboksimetil selülozun (CMC) 1:1 karışımını içeren, %10 FBS ile desteklenmiş ve nihai CMC konsantrasyonu %3 olan overlay ekleyin; 34 °C'de %5 CO₂ ile 48 sa boyunca inkübe edin.
NOT: Enfeksiyon aşamasında, overlay karışımını 37 °C su banyosunda 15 dk ön ısıtmaya tabi tutun. CMC yerine, %1 agaroz ile %10 FBS ile desteklenmiş 2x DMEM'in 1:1 karışımı kullanılabilir. Agaroz ile overlay yapmak için, %1 agarozu (dH₂O içinde) kaynatın ve soğuk 2x DMEM ile karıştırın. Hücre monotabakasına eklemeden önce karışımın uygun bir sıcaklıkta (yaklaşık 37-40 °C) olduğundan emin olun. Overlay için agaroz kullanılırsa, boyama işleminden önce hücreler, 2 mL 3:1 metanol:asetik asit içinde en az bir saat inkübe edilerek fikse edilmelidir.
2. Boyama ve viral titrenin hesaplanması
1. Plaklar, kristal viyole ile boyama yapılarak veya eGFP'nin floresan mikroskop altında doğrudan görüntülenmesiyle görselleştirilir.
2. Plakları boyamak için overlay tabakasını aspire edin, PBS ile bir kez yıkayın ve ardından her bir kuyucuğa 2 mL %0,1 kristal viyole (%80 metanol ve dH₂O içinde) ekleyin. Boya giderme işleminden önce yaklaşık 20 dakika boyunca oda sıcaklığında bir plak sallayıcı üzerinde bekletin. Kristal viyoleyi uzaklaştırın ve her bir kuyucuğu dH₂O veya PBS kullanarak nazikçe iki kez yıkayın.
NOT: Hücre monokatmanının işlem boyunca bozulmadan kalmasını sağlamak için yıkama ve boyama adımları, her kuyucuğun kenarına doğru yavaşça pipetleme yapılarak nazikçe gerçekleştirilmelidir.
3. Plakları saymadan önce plakların en az 1 sa boyunca kurumasına izin verin. Plak sayımlarının, 20 ila 200 plak içeren kuyucuklardan elde edildiğinden emin olun. Virüs titresini mL başına plak oluşum birimi (PFU) cinsinden hesaplamak için, sayılan kuyucuğun dilüsyon faktörünü enfeksiyon hacmi ile çarpın ve ilgili kuyucukta bulunan plak sayısını bu sayıya bölün.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 0.25% trypsin-EDTA (Gibco) | Fisher scientific | LS25200114 | |
| Vero E6 hücreleri | ATCC | CRL-1586 | |
| karboksimetil selüloz | Sigma | C5678 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (Gibco) | Fisher scientific | 10-013-CV | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (Toz) (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 12-800-017 | |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Fisher scientific | 21-031-CV | |
| Penisilin/streptomisin | Thermo Fisher Scientific | 15070063 | |
| SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Nötralize Edici Antikor, Mouse Mab | SinoBiological | 40592-MM57 |
