Hasta Serumu Kullanarak Koronavirüs Spike Proteini Eksprese Eden Psödovirüslerin Antikor Aracılı Nötralizasyonu

Özet

Kaynak: Jamieson, T. R., et al. Detection of SARS-CoV-2 Neutralizing Antibodies using High-Throughput Fluorescent Imaging of Pseudovirus Infection. J. Vis. Exp. (2021)

Bu video, enfekte edilmiş epitelyal hücre monokatmanlarının yüksek kapasiteli floresan görüntülemesi yoluyla incelenen, koronavirüs spike proteinleri taşıyan psödovirüslerin hasta serumu kullanılarak antikor aracılı nötralizasyonunu göstermektedir.

Protokol

Örnek toplamayı içeren tüm prosedürler, kurumun IRB yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.

1. Antikor veya serum dilüsyonları ve enfeksiyonlar

NOT: Bu protokol, koronavirüs spike proteini ve geliştirilmiş yeşil floresan protein (VSV-S-eGFP) eksprese eden veziküler stomatit virüsü psödovirüsünün hem ticari olarak temin edilebilen antikorlar ve hasta serumu hem de preklinik aşı geliştirme çalışmaları için hayvanlardan toplanan serumlar tarafından nötralizasyonunu ölçmek için uygulanabilir.

1. Seri dilüsyon serisi
   1. Serum örneklerini dilüe etmeden önce, komplemanı inaktive etmek için her örneği 56 °C'lik su banyosunda 30 dk boyunca ısı ile inaktive edin. Hasta örneklerini işlerken gerekli güvenlik önlemlerinin alındığından emin olun; örnek kaplarını yalnızca doku kültürü önlemi altında açın ve uygun biyogüvenlik seviyesi 2 kişisel koruyucu ekipman giyildiğinden emin olun.
   2. Dilüsyon serisini boş bir 96 kuyucuklu plakta (Plak 1) hazırlayın.
   3. 96 kuyucuklu plağın A Sırasındaki tüm dilüsyonlara 80 µL ile başlayın. *Hasta örnekleri için, 8 µL serumu 72 µL serumsuz Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) ( %1 penisilin/streptomisin içeren) içine ekleyerek dilüsyon serisine 1:10 oranında başlayın.
      NOT: Kullanılan nötralize edici antikor konsantrasyonu, üretici tarafından öngörülen aktiviteye bağlı olacaktır. Burada kullanılan SARS-CoV-2 Spike nötralize edici antikoru için (bkz. Materyaller Tablosu), en az %50 nötralizasyon gözlemlemek için 5 µg/mL ile başlayın.
   4. B ile G arasındaki sıralara 40 µL serumsuz DMEM (%1 penisilin/streptomisin içeren) ve H sırasına 80 µL ekleyin. H sırası yalnızca hücre kontrolü olarak hizmet ettiğinden, bu sıraya virüs eklemeyin.
   5. 12 kanallı bir multichannel pipet kullanarak, A sırasındaki dilüe edilmiş serum veya antikorun 40 µL'sini karıştırıp B sırasına aktarın. Karıştırın ve F sırasına kadar tekrarlayın, ardından F sırasından 40 µL atın. G sırası yalnızca virüs kontrol sırasını temsil ettiğinden, bu sıraya serum eklemeyin.
2. Enfeksiyon ve overlay (örtme) işlemi
   1. Her bir kuyucuğu 0,05 enfeksiyon multiplicities (MOI) (veya 2000 plak oluşturan birim (pfu)) ile işlemek için uygun hacimde dilüe VSV-S-eGFP hazırlayın. (Bu hesaplamayı yaparken, toplam 80 µL hacmin sadece 60 µL'sinin hücrelerin üzerine aktarılacağını unutmayın; bu nedenle, 2000 pfu'yu korumak için virüs hacmini 1,33 ile çarptığınızdan emin olun).
      NOT: VSV-S-eGFP sıcaklığa duyarlı olduğundan, viral stokların kullanılmadıkları her an buz üzerinde kalmasını sağlayın ve tekrarlanan dondurma işlemlerinden sonra titreler değişeceği için çoklu dondurma-çözme döngülerinden kaçının.
   2. Plak 1'in A ile G arasındaki sıralarındaki her bir kuyucuğa 40 µL dilüe virüs ekleyin ve pipetleme yaparak 4-5 kez aşağı yukarı karıştırın. Plağı 37 °C'de %5 CO₂ ile 1 saat inkübe edin.
   3. Hücre içeren plağı inkübatörden çıkarın (Plak 2) ve tüm kuyucuklardaki medyumu dikkatlice aspire edin. Plak 1'den Plak 2'ye 60 µL antikor/virüs karışımı aktarın ve plağı her 20 dakikada bir sallayarak 37 °C'de %5 CO₂ ile 1 saat inkübe edin.
   4. Her bir kuyucuğu, final konsantrasyonu %3 CMC olacak şekilde DMEM içinde karboksimetil selüloz (CMC) içeren ( %10 FBS (Fetal bovine serum) ve %1 penisilin/streptomisin ile) 140 µL overlay ile tamamlayın. Görüntüleme öncesinde Plak 2'yi 34 °C'ye ayarlanmış %5 CO₂ içeren bir inkübatörde yaklaşık 24 saat bekletin.
      NOT: Enfeksiyon adımı sırasında overlay karışımını 37 °C'lik su banyosunda 15 dk boyunca ön ısıtmaya tabi tutun.

2. Görüntüleme ve kantifikasyon (3. Gün)

1. Otomatik bir floresan görüntüleyici kullanarak (floresein izotiyosiyanat (FITC) filtresi veya 488 nm uyarım dalga boyuna sahip alternatif bir filtre kullanarak) plakların görüntülerini alın. Münferit eGFP (geliştirilmiş yeşil floresan protein) odaklarını otomatik olarak tanımlayan ve sayan bir protokol oluşturarak viral enfeksiyonu nicelleştirin. Otomatik sayma özelliği mevcut değilse, eGFP odaklarının sayısını belirlemek için ImageJ yazılımını kullanın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Karboksimetil selüloz	Sigma	C5678
Dulbecco modifiyeli Eagle besiyeri (Gibco)	Fisher scientific	10-013-CV
Dulbecco modifiyeli Eagle besiyeri (Toz) (Gibco)	Thermo Fisher Scientific	12-800-017
Vero E6 hücreleri	ATCC	CRL-1586
Dulbecco Fosfat Tamponlu Tuzlu Su (DPBS)	Fisher scientific	21-031-CV