Floresan Raporlayıcılar Kullanarak Vaccinia Virüsünde Evreye Özgü Gen Ekspresyonunun İzlenmesi

Özet

Kaynak: Rozelle, D. K., et al. Vaccinia Reporter Viruses for Quantifying Viral Function at All Stages of Gene Expression. J. Vis. Exp. (2014)

Bu video, evreye özgü promotörler tarafından düzenlenen floresan raporlar kullanarak vaccinia virüsü replikasyonunun izlenmesine yönelik bir yöntemi göstermektedir. Yeşil, kırmızı ve mavi floresan proteinlerin ardışık ekspresyonu; enfeksiyonun erken, orta ve geç evrelerini işaretleyerek evreye özgü viral gen ekspresyonunun yüksek çıktılı analizine olanak tanır.

Protokol

1. Hücrelerin Plakaya Ekilmesi

1. HeLa hücrelerini plakadan ayırın ve büyüme besiyerinde (Dulbecco's Modified Eagle Medium [DMEM], 2 mM L-glut, %10 fetal bovine serum [FBS]) yaklaşık 2.0 x 10⁵ hücre/ml olacak şekilde seyreltin. Siyah duvarlı, şeffaf düz tabanlı 96 kuyucuklu bir plakaya kuyucuk başına 100 μl dağıtın (20.000 hücre/kuyucuk).
2. Hücreleri, konfluens olana kadar 37 °C inkübatör + %5 CO₂ ortamında 24 saat inkübe edin.

2. Hücrelerin enfekte edilmesi

1. Virüsleri seyreltin ve hücreleri enfekte edin.
   1. TrpV (Üçlü virüs; Erken Venus, Ara mCherry, Geç TagBFP) ve PLV (Promotörsüz Venus) floresan virüslerini çözdürün ve 5 dakika boyunca sonikasyon kullanarak agregatları dağıtın. Alternatif olarak, ham virüs stokları enfeksiyon ortamındaki 0.25 mg/ml tripsin ile 1:1 oranında karıştırılabilir ve 37 °C'de 30 dakika inkübe edilebilir.
   2. Ham virüs stoklarını 37 °C enfeksiyon ortamında (DMEM, 2 mM L-glut, 2% FBS) seyreltin. Yüksek MOI enfeksiyonları (10 PFU/hücre) için, kuyuk başına 5 x 10⁴ hücre ve 50 μl inokülüm hacmi varsayarak virüs stoğunu 1.0 x 10⁷ PFU/ml olacak şekilde seyreltin. Her bir işlem için TrpV ile 3 replika kuyuyu ve her bir işlem için PLV ile diğer 3 replika kuyuyu enfekte etmeyi planlayın; böylece her işleme özgü arka plan floresansı hesaba katılmış olur.
   3. Kuyuklara enfeksiyon ortamında seyreltilmiş virüsten 50 μl/kuyu ekleyerek enfekte edin. Bu an, enfeksiyon sonrası zaman = 0 saat (0 hpi) olarak tanımlanır.
2. 37 °C inkübatör + 5% CO₂ ortamında 6-24 saat inkübe edin.

3. Hücrelerin fiksasyonu

1. Her bir kuyuctaki enfeksiyon ortamına 100 μl %8 paraformaldehit ekleyerek hücreleri sabitleyin. Işıktan koruyarak oda sıcaklığında 15 dk inkübe edin.
   NOT: Yüksek titreli ortamın fiksasyon öncesinde doğrudan atık kabına boşaltılması durumunda oluşabilecek enfeksiyöz vaccinia aerosolizasyonunu önlemek için, 2x Paraformaldehit (%8) doğrudan enfeksiyon ortamına eklenmesi önerilir.
2. Plakayı atık kabına ters çevirerek fiksatifi uzaklaştırın.
3. 100 μl oda sıcaklığında fosfat tamponlu salin ekleyin.
4. Plakayı optik olarak şeffaf yapışkan filmle mühürleyin.
   NOT: Hemen okuma yapılmayacaksa plakalar 4 °C'de saklanabilir. Kondansasyonun spektrofotometre ölçümlerini bozmasını önlemek için, okuma yapmadan önce mühürlü plakaların oda sıcaklığına geri döndürüldüğünden emin olun.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	11995-065
Fetal Bovine Serum - Optima, Isı İnaktive (FBS)	Atlanta Biologicals	S12450H
200 mM L-Glutamin (L-glut)	Gibco	25030-081
96 Kuyucuklu Düz Şeffaf Tabanlı Siyah Polistiren TC-İşlem görmüş Mikroplakalar	Corning	3603
Fosfat Tamponlu Salin (PBS)	Gibco	10010-023
TempPlate RT optik olarak şeffaf film	USA Scientific	2978-2700
Opti-MEM Azaltılmış Serum Ortamı	Gibco	31985-070