Enfekte Böcek Vücutlarından Virüslerin İzolasyonu ve Saflaştırılması

Özet

Kaynak: Biesbrock, A. M. et al. Propagation of Homalodisca coagulata virus-01 via Homalodisca vitripennis Cell Culture. J. Vis. Exp. (2014)

Bu video, böcek kaynaklı konak hücreler kullanılarak Homalodisca coagulata Virus-01'in in vitro propagasyonunu göstermektedir. Videoda virüs saflaştırma, inokülasyon ve kültürlenmiş böcek hücreleri içindeki replikasyon adımları ana hatlarıyla açıklanmaktadır.

Protokol

1. Tüm Virüs Ekstraksiyonu

1. Virüs pozitif H. vitripennis'in tüm vücutlarını, pH ~7.2'de 0.02% sodyum dietilditiyokarbamat trihidrat (DETCA) içeren fosfat tamponu içinde, büyük doku kümeleri kalmayana kadar ~10 saniyelik aralıklarla vorteksleyerek homojenize edin. Virüsü, 4 °C'de 4 saat boyunca 124,500 x g veya 4 °C'de 16 saat boyunca 22,000 x g hızında süper hızlı santrifüjle ekstrakte edin. Üst kısımda bir çökelek oluşursa, bunu steril bir pamuklu çubukla temizleyin.
2. Süpernatantı atın.
3. Pelleti toplayın ve 0.4% Na-deoksikolik asit ve 4% polietilen glikol heksadesil eter (Brij 52) içeren, pH ~7.2'de 5 ml 10 mM fosfat tamponu (DETCA içermeyen) ile çözün.
   1. Pelleti iyi karıştırmak için, gerekirse pelleti tüpün kenarından ayırın ve çözünene kadar ezin.
   2. İhtiyaç duyulursa, pelletin çözünmesine yardımcı olmak için 10 mM fosfat tamponunu ~5 ml'lik artışlarla ekleyin ve içeriği 2 tüpte birleştirin.
4. Çözeltiyi 300 x g'de 15 dakika santrifüjleyin.
5. Süpernatantı uzaklaştırın, çözeltiyi 0.45 μm'lik bir filtreden geçirin ve filtratı geniş bir toplama tüpüne toplayın.
6. Filtratı, gerekirse DETCA içermeyen az miktarda 10 mM fosfat tamponu (pH 7) kullanarak, 3.5 kD moleküler ağırlık kesme sınırına (MWCO) sahip bir diyaliz membranına aktarın.
7. Diyaliz membranını, 4 °C'de ddH₂O ile doldurulmuş geniş bir behere yerleştirin. Membran içinde beyaz bir çökelek oluşana kadar, 5 - 6 saat boyunca ddH₂O'yu her saat başı değiştirin.
8. Saflaştırılmış virüsü membranın içinden toplayın ve 10 μl çözeltiyi 90 μl ddH₂O'ya ekleyerek %100'lük virüs çözeltisini 10 katlık bir dilüsyon serisine tabi tutun. Ardından, 1:100,000 dilüsyona ulaşana kadar dilüsyondan 10 μl'yi başka bir 90 μl ddH₂O'ya ekleyin.
9. Virüs çözeltisini -80 °C'de saklayın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Corning hücre kültürü flaskları	Sigma Aldrich	CLS430168	Yüzey alanı 25 cm², eğimli boyun, kapak (tıpa sızdırmazlık)
Olympus DP30BW, IX2-SP, IX71	Olympus		Evirtilmiş mikroskop ve kamera
Greiner CELLSTAR çok kuyucuklu kültür plakaları	Sigma Aldrich	M8937	48 kuyucuklu (kapaklı, TC işlem görmüş)
DETCA	Sigma Aldrich	228680	Sodyum dietilditiyokarbamat trihidrat
Corning şişe üstü vakum filtre sistemi	Sigma Aldrich	CLS431206	Selüloz asetat membran, gözenek boyutu 0.45 μm, membran alanı 54.5 cm², filtre kapasitesi 500 ml
Brij 52	Sigma Aldrich	388831	Polietilen glikol heksadesil eter
Fosfat tampon çözeltisi	Sigma Aldrich	P5244	100 mM olarak alınmış, steril su ile 10 mM'ye seyreltilmiştir
PBS	Sigma Aldrich	P5368	Fosfat tamponlu salin
Sığır serum albümini (BSA)	Sigma Aldrich	A2153
Grace böcek besiyeri (takviyeli, 1x)	Sigma Aldrich	G8142	H2G+ yaprak biti besiyeri bileşeni
L-histidin monohidrat	Sigma Aldrich	H8125	H2G+ yaprak biti besiyeri bileşeni
Medium 199 (10x)	Sigma Aldrich	M4530	H2G+ yaprak biti besiyeri bileşeni
Medium 1066 (1x)	Sigma Aldrich	C0422	H2G+ yaprak biti besiyeri bileşeni
Hank's Dengeli Tuzlar (1x)	Sigma Aldrich	51322C	H2G+ yaprak biti besiyeri bileşeni
L-Glutamin (100x)	Sigma Aldrich	G3126	H2G+ yaprak biti besiyeri bileşeni
MEM, amino asit karışımı (50x)	Sigma Aldrich	56419C	H2G+ yaprak biti besiyeri bileşeni
1 M MgCl çözeltisi	Sigma Aldrich	M8266	H2G+ yaprak biti besiyeri bileşeni
Pen-Strep	Sigma Aldrich	G6784	H2G+ yaprak biti besiyeri bileşeni
Nistatin	Sigma Aldrich	N6261	H2G+ yaprak biti besiyeri bileşeni
Gentamisin	Sigma Aldrich	46305	H2G+ yaprak biti besiyeri bileşeni
Dekstroz	Sigma Aldrich	D9434	H2G+ yaprak biti besiyeri bileşeni
Fetal Sığır Serumu	Sigma Aldrich	F2442	H2G+ yaprak biti besiyeri bileşeni