1. Transkripsiyon faktörleri için konsantre bir lentivirüs paketleme sisteminin oluşturulması Konsantre virüs üretimi (Şekil 1A, B) 1.1.1. 1,5 × 10⁶ HEK (insan embriyonik böbrek)-293T hücresini 60 mm'lik bir kaba ekle ve bu hücreleri 37 °C'de, %5 CO₂ içeren nemlendirilmiş bir inkübatörde normal besiyeri ile kültüre et (bkz. Tablo 1). NOT: Virüsün partiler halinde paketlenmesi gerekiyorsa, 100 mm'lik bir hücre kültürü kabı kullanılabilir (ayrıntılar için bkz. Tablo 2). 1.1.2. 24 saat sonra, transduksiyon gününde HEK-293T hücrelerinin %80-90 konfluense ulaştığından emin ol ve besiyerini 3,5 mL DMEM (Dulbecco modifiye eagle besiyeri) (1 cm² başına 150 µL DMEM) ile değiştir. Hücreleri 37 °C'de, %5 CO₂ içeren nemlendirilmiş bir inkübatörde 2 saat beklet. NOT: Hücrelerin daha iyi plazmit transfeksiyonu için "aç bırakılabilmesi" amacıyla, değişimde kullanılan besiyeri serumsuz olmalıdır. 1.1.3. Mitf, Sox10, Pax3, Sox2, Sox9 veya Snai2 hedef plazmitlerinden 3 µg; paketleme plazmidi PMD2.G'den 1 µg ve paketleme plazmidi PSPAX2'den 2 µg içeren plazmit karışımını (karışım A) hazırla. Karışım A'nın hacmini serumsuz DMEM ile 150 µL'ye tamamla. 12 µL transfeksiyon reaktifi ekleyerek (hacim, tüm plazmitlerin toplam kütlesinin iki katıdır) transfeksiyon reaktifi karışımını (karışım B) hazırla ve karışım B'nin hacmini serumsuz DMEM ile 150 µL'ye tamamla. NOT: Karışımlar hazırlanırken, hava kabarcıklarını önlemek için sıvının yavaşça eklenmesi önemlidir. 1.1.4. Karışım A ve karışım B'yi oda sıcaklığında 5 dakika beklettikten sonra birleştir. Transfeksiyon kompleksinin oluşması için karışımı oda sıcaklığında 20-30 dakika inkübe et. 1.1.5. HEK-293T hücrelerini inkübatörden çıkar, besiyerini DMEM + %2 FBS (fetal sığır serumu) ile değiştir, 1.1.4 adımındaki karışımı damla damla ekle ve sıvıyı nazikçe karıştır. 1.1.6. 8 saat sonra, besiyerini 3,5 mL normal besiyeri ile değiştir. Besiyeri değişiminden sonra, virüs süpernatanını her 24. ve 48. saatte topla. 1.1.7. İki farklı zaman noktasında toplanan virüs süpernatanlarını karıştır. 4 °C'de, 5 dakika boyunca 200 × g'de santrifüjle. Süpernatanı 0,45 µm'lik filtrelerden geçir ve 50 mL'lik steril konik bir tüpe topla. NOT: 24. saatte toplanan virüs 4 °C'de saklanabilir ve 48. saatte toplanan virüs ile karıştırılabilir. 1.1.8. Virüs süpernatanını 4 °C'de gece boyunca (~16 saat) 6000 × g'de santrifüjleyerek konsantre et. Santrifüj sonrası konik tüpün dibinde virüs peletinin görünür olduğundan emin ol. 1.1.9. Süpernatanı yavaşça dök. Virüs peletini, virüs süpernatanı hacminin 1/100'ü kadar normal besiyeri hacminde çöz. P1000 mikropipet kullanarak, homojen bir karışım elde edilene kadar nazikçe pipetle. Konsantre virüsü gerektiği gibi mikrosantrifüj tüplerine böl. −80 °C'de sakla. NOT: Bu yöntemle virüs 100 kat konsantre edilir. Konsantre virüs (100x), −80 °C'de 1 yıldan fazla süreyle saklanabilir. Virüsün tekrarlı dondurulup çözülmesinden kaçın. Tablo 1: Normal ve yeniden programlama besiyerlerinin bileşenleri. Bileşenler | Doz (konsantrasyon, hacim) | Final Konsantrasyonu --- | --- | --- Normal Besiyeri (100 mL) | | DMEM/YÜKSEK GLUKOZ | 89 mL | Isı ile inaktive edilmiş FBS | 10 mL | Antibiyotikler (Pen/Strep) | 10000 U/mL, 1 mL | 100 U/mL Yeniden programlama besiyeri (100 mL) | | RPMI-1640 | 88 mL | Isı ile inaktive edilmiş FBS | 10 mL | Rekombinant İnsan SCF | 200 μg/mL, 50 μL | 100 ng/mL Rekombinant İnsan bFGF | 4 μg/mL, 250 μL | 10 ng/mL Rekombinant İnsan insülin | 10 mg/mL, 50 μL | 5 μg/mL EDN3 insan | 100 μM, 100 μL | 0,1 μM Kolera Toksini | 0,3 mg/mL, 0,56 μL | 20 pM Forbol 12-miristat 13-asetat (TPA) | 1 mM, 20 μL | 200 nM Hidrokortizon | 100 μg/mL, 500 μL | 0,5 μg/mL Adenin | 40 mg/mL, 60 μL | 24 μg/mL Tablo 2: Lentivirüs paketleme sisteminin ayrıntıları. Kültür Kabı | Ekim Yoğunluğu (hücre/kap) | Besiyeri (mL) | Plazmit Sistemi | Transfeksiyon reaktifi (µL) | Hedef plazmit (μg) | PMD2.G (μg) | PSPAX2 (μg) --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- 35 mm | 6 × 10⁵ | 1,5 | 1,5 | 0,5 | 1 | 6 | 6 60 mm | 1,5 × 10⁶ | 3,5 | 3 | 12 | 12 | 1 | 0 100 mm | 4 × 10⁶ | 8 | 8 | 36 | 34 | | Zhang, Y., ve ark.Fare Fibroblastlarının Melanositlere Doğrudan Yeniden Programlanması. J. Vis. Exp. (2021)
Bu video, transkripsiyon faktörlerinin veya diğer genetik elementlerin hücresel yeniden programlama, fonksiyonel çalışmalar ve potansiyel terapötik araştırmalar gibi uygulamalar için verimli gen iletimini sağlayan, memeli hücrelerde rekombinant lentivirüs üretimini ve konsantrasyonunu göstermektedir.
