Bu video, Ebola virüsü genomunu taklit eden tetrasistronik bir minigenom plazmidinin, yardımcı plazmidlerle birlikte insan hücrelerine nasıl transfekte edildiğini göstermektedir. Hücrelerin içinde viral proteinler ve lüsiferaz eksprese edilerek, patojenik olmayan ve replikasyon yeteneğine sahip virüs benzeri partiküllerin birleşimi ve tomurcuklanması sağlanır.
Yöntem makalesi
Raporlayıcı İçeren Ebola Virüsü Transkripsiyon ve Replikasyon Yetenekli Virüs Benzeri Partiküllerin Üretimi
36 görüntülenme
⸱
30 Eylül 2026
Bu makalede
Özet
Protokol
1. Transkripsiyon ve Replikasyona Yetkin Virüs Benzeri Partiküllerin (trVLP'ler) İlk Üretimi için Üretici Hücrelerin Transfeksiyonu
- Hücrelerin bölünmesinden 24 hr sonra (deney zamanlamasına genel bir bakış için Şekil 1'e bakınız), filtreli uçlar kullanarak plasmid DNA'yı (miktarlar için Tablo 1'e bakınız) steril bir 2 mL kriyotüpe pipetleyin. DNA'ya kuyucuk başına 100 µL OptiMEM ekleyin. Karışımı kısa süre vorteksleyin ve mikrofüj kullanarak tüpleri nazikçe çöktürün. Eğer birden fazla kuyucuk aynı plasmidlerle transfekte edilecekse, birkaç kuyucuk için bir master mix hazırlanabilir.
- Kullanmadan önce Transit LT1 içeren şişeyi kısa süre vorteksleyin. Seyreltilmiş DNA'ya kuyucuk başına 7.5 µL Transit LT1 ekleyin. Kriyotüp kapağında sıvı birikmemesine dikkat ederek karışımı nazikçe vorteksleyin ve oda sıcaklığında 15 min inkübe edin.
- Transfeksiyon kompleksini, pipetle yukarı-aşağı çekerek nazikçe karıştırın. Her bir kuyucuğa 100 µL transfeksiyon kompleksini damla damla ekleyin. Transfeksiyon komplekslerini dağıtmak için plakayı öne/arkaya ve yanlara doğru sallayın. Transfeksiyon komplekslerinin düzensiz yayılmasına neden olacağı için plakayı dairesel olarak döndürmeyin.
- Hücreleri inkübatöre geri yerleştirin.
- 24 hr sonra, hücrelerin üzerindeki süpernatantı uzaklaştırın. Hücrelere %5 FBS (Fetal Bovine Serum), 2 mM L-glutamin, 1x pen/strep (Penisilin/Streptomisin) içeren 4 mL DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) (DMEM5) ekleyin. Kuyucukların aynı örnekleri içerdiği varsayılırsa, bu adım kuyucuklar kurumadan aynı anda 3 kuyucuğa kadar uygulanabilir (aksi takdirde, bu sistemdeki trVLP'lerin (Transkripsiyon ve Replikasyon Yeteneğine Sahip Virüs Benzeri Partiküller) kendini çoğaltan doğası nedeniyle çapraz kontaminasyon sorunu oluşabilir ve bu adım her seferinde tek bir kuyucuk için yapılmalıdır).
- Hücreleri inkübatöre geri yerleştirin.
Tablo 1. Transfeksiyon için DNA miktarları. Üretici ve hedef hücrelerin transfeksiyonu için gereken her bir plazmit miktarı, 6 kuyucuklu bir plakanın kuyucuk başına ng cinsinden gösterilmiştir.
| Üretici Hücreler (p0) | Hedef Hücreler (p1 ve üzeri) | |
| pCAGGS-NP | 125 | 125 |
| pCAGGS-VP35 | 125 | 125 |
| pCAGGS-VP30 | 75 | 75 |
| pCAGGS-L | 1,000 | 1,000 |
| p4cis-vRNA-RLuc | 250 | - |
| pCAGGS-T7 | 250 | - |
| pCAGGS-Tim1 | - | 250 |
Sonuçlar
Şekil 1. Ardışık 3 pasaj için tetrasistronik trVLP analizinin zamanlaması. Hücrelerin ekilmesi (s), hücrelerin transfekte edilmesi (t), hücrelerin enfekte edilmesi (i), besiyeri değişimi (c) ve hücrelerin ile trVLP'lerin hasat edilmesi (h) günleri, ardışık üç pasaj için (oklarla) belirtilmiştir.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 75 cm² hücre kültürü flaskı | Corning | 430641 | |
| DMEM | Sigma | D6546 | Kullanımdan önce 37°C'ye kadar ön ısıtma yapın |
| FBS | Life technologies | 26140-079 | 56°C'de 30 dk boyunca ısı ile inaktive edin |
| L-Glutamin | Life Technologies | 25030-081 | 100x |
| Pen/strep | Life Technologies | 15070-063 | 100x |
| 6 kuyucuklu plaklar | Costar | 3516 | |
| Opti-MEM I | Life Technologies | 31985-070 | |
| Transit LT1 | Mirus | MIR 2300 |
