1. Firefly lükiferaz ekspres eden kızamık virüsü (rMV2/Luc) ile enfekte edilmiş hücre kültürlerinin hazırlanması HEK-293T hücrelerini 37 °C'de ve %5 CO2'de, stabilize L-glutamin içeren, %10 fetal calf serum (FCS), streptomisin (100 μg/ml) ve penisilin (100 IU/ml) ile desteklenmiş Dulbecco modifiye Eagle ortamında (DMEM) büyütün. Hücreler her 4-5 günde bir tripsinizasyon ile pasajlanmalı ve taze bir flaska 1:10 oranında dilüe edilmelidir. Deneyler için hücrelerin log fazında olması gerekir. Deney gününde, hücreleri tripsinizasyon ile geri kazanın ve hücre sayımı yapın. Hücreleri santrifüj ile pelletleyin ve kültür ortamında 3 x 10⁵ hücre/ml olacak şekilde resüspande edin. Her bir tarama plakası için 12,5 ml hücre süspansiyonu gerektiğini dikkate alın. Hücreleri kültür ortamında tekrar 3 x 10⁵ hücre/ml olacak şekilde resüspande edin. Her bir tarama plakası için 12,5 ml hücre süspansiyonu gerektiğini dikkate alın. Opsiyonel: Kültür ortamını 20 μg/ml üridin ile destekleyin. NOT: Viral replikasyon inhibitörleri için kimyasal kütüphaneler tarandığında, pirimidin biyosentez yolunun erken basamaklarını hedefleyen bileşiklerin sıklıkla izole edildiği görülmektedir. Kültür ortamına üridin eklenmesi, bu tür antiviral molekülleri filtrelemek için kullanılır. Nitekim bu işlem, pirimidin biyosentez yolunun yukarı akış enzimlerinin engellendiği durumlarda viral replikasyonu etkili bir şekilde geri döndürür. Hücre süspansiyonunun 1/10'unu enfekte edilmemiş hücreli kontrol kuyucukları için ayırın ve kalan hacimle enfeksiyona geçin. Uygun hacimdeki rMV2/Luc stok çözeltisini çözün. MV stok çözeltileri genellikle ml başına 10⁶-10⁸ enfeksiyöz partikül konsantrasyonundadır. Kültür, hedef hücre başına 0,1 enfeksiyöz rMV2/Luc partikülü ile enfekte edilmelidir; bu, 0,1 enfeksiyon çokluğu (MOI) değerine karşılık gelir. NOT: rMV2/Luc, MV aşısından (Schwarz suşu) türetilmiştir ve BSL2 ortamında manipüle edilir. Virüsü hücre süspansiyonuna ekleyin ve nazikçe karıştırın. Enfekte hücreleri bir hazneye aktarın ve enfekte hücre süspansiyonunun 100 μl'sini, işaretli kimyasal bileşikler içeren D2 plakalarının 2 ile 11 arasındaki sütunlarına dağıtın. Hazne içindeki hücre süspansiyonu düzenli olarak nazikçe karıştırılır. 1. ve 12. sütunlardaki her bir kuyucuğa 100 μl enfekte edilmemiş hücre dağıtın. Diğer kuyucuklara enfekte hücreler dağıtılır. Hücreleri 37 °C'de ve %5 CO2'de 24 saat inkübe edin. 2. Toksisite ve Geniş Spektrumlu Antiviral Aktivite için İkincil Tarama Her bir hit bileşik için dimetilsülfoksit (DMSO) içinde, 500 µM'den 4 µM'ye kadar 1:2 seri dilüsyonlar hazırlayın (8 dilüsyon). Barkodlu beyaz doku kültürü plakalarını 50 µl kültür ortamı ile doldurun. Kültür kuyucuklarına her bir bileşik dilüsyonundan 1 µl ekleyin. Her bir hit bileşik için duble seri dilüsyonlar içeren 3 kültür plakası elde etmek için işlemi iki kez tekrarlayın. Yukarıda açıklanan şekilde (1.1 ve 1.2'de), kültür ortamında 6 x 10⁵ hücre/ml konsantrasyonunda 37,5 ml HEK-293T hücre süspansiyonu hazırlayın. 2 x 12,5 ml'yi Falcon tüplerine dağıtın ve hücreleri ya MOI = 0,1 oranında rMV2/Luc ile ya da MOI = 0,2 oranında Renilla lükiferaz ekspres eden rekombinant chikungunya virüsü (CHIKV/Ren) ile enfekte edin. Ters çevirerek karıştırın. NOT: CHIKV/Ren, bir CHIKV vahşi tip suşundan türetilmiştir ve bu nedenle BSL3 ortamında manipüle edilmelidir. Renilla substratı kültür kuyucuklarına eklendikten sonra (aşağıya bakınız), plakalar BSL3'ten BSL1'e taşınabilir. Hit bileşiklerin seri dilüsyonlarını içeren kültür plakalarına 50 µl enfekte edilmemiş, rMV2/Luc-enfekte veya CHIKV/Ren-enfekte hücre dağıtın. 37 °C'de 24 saat inkübe edin. rMV2/Luc-enfekte kuyucuklarda firefly lükiferaz aktivitesini belirlemek için 50 µl firefly lükiferaz substratı ekleyin. CHIKV/Ren-enfekte kuyucuklarda Renilla lükiferaz aktivitesini belirlemek için 50 µl Renilla lükiferaz substratı ekleyin. Son olarak, hücresel canlılığı belirlemek için enfekte edilmemiş hücrelere 50 µl lükiferaz tabanlı canlılık analizi reaktifi ekleyin. Verileri grafikleştirin (Şekil 1) ve MV ve CHIKV replikasyonunu %50 oranında inhibe eden hit bileşik konsantrasyonlarını belirleyin. Bu analizde bir miktar toksisite gösteren bileşikleri dikkate almayın. Lucas-Hourani, M. ve ark., RNA Virüslerine Yönelik Geniş Spektrumlu Kimyasal İnhibitörler için Yüksek Kapasiteli Tarama. J. Vis. Exp. (2014)
Bu video, rekombinant kızamık virüsü ile enfekte edilmiş insan embriyonik böbrek hücrelerinde gerçekleştirilen lusiferaz tabanlı bir antiviral testi göstermektedir. Seri olarak seyreltilmiş test bileşiklerinin, konak hücre canlılığını korurken viral replikasyonu inhibe ederek doz bağımlı şekilde daha düşük lüminesansa yol açtığı görülmektedir.
