Amoebalar Kullanılarak Karışık Bir Viral Popülasyondan Tek Bir Dev Virüsün İzolesi

Özet

Kaynak: Sahmi-Bounsiar, D. et al. Dev Virüs Karışımlarının Ayrılması için Floresan Aktive Hücre Ayıklamaya Alternatif Bir Strateji olarak Tek Hücreli Mikro-aspirasyon. J. Vis. Exp. (2019)

Bu video, konak hücreler olarak amipleri kullanarak, karışık bir viral popülasyondan tek bir dev virüs popülasyonunu izole etmek ve çoğaltmak için tek hücreli mikro-aspirasyon yöntemini göstermektedir.

Protokol

1. Amip Kültürü

1. Kullanım Vermamoeba vermiformis (suş CDC19) hücre desteği olarak.
2. 30 mL proteaz-pepton-maya ekstraktı-glikoz besiyeri (PYG) ekleyin (Tablo 1) ve 1 x 10 konsantrasyonundaki 3 mL amöba⁶ 75 cm'lik bir kapta hücre/mL² hücre kültürü flaskı.
3. Kültürü şu koşullarda muhafaza edin: 28 °C.
4. 48 saat sonra, sayım lamları kullanarak amipleri nicellendirin.
5. Durulama işlemi için hücreleri 1 x 10¹⁰ konsantrasyonunda hasat edin⁶ hücre/mL ve amipleri 720 x g'de 10 dakika boyunca santrifüjleyerek çöktürün. Süpernatantı uzaklaştırın ve 1 x 10 elde etmek için pelletini uygun hacimdeki açlık ortamında yeniden süspanse edin⁶ hücre/mL (Tablo 1).

2. Uç nokta dilüsyonu

1. Viral örneğin açlık ortamında seri dilüsyonunu (10^-1 ile 10^-11 arası) gerçekleştirin (Tablo 1).
2. Her bir Petri kabındaki 2 mL 1 x 10⁶ Vermamoeba vermiformis örneğine 100 µL karışım inokülumu ekleyin.
3. Petri kaplarını 30 °C'de, ağzı kapatılabilir plastik bir torbaya yerleştirin.
4. Enfeksiyondan 6 saat sonra inverted optik mikroskobu ile Petri kaplarını gözlemlemeye başlayın ve hücre morfolojisini her 4 ila 8 saatte bir kontrol edin.
5. Hücrelerin yuvarlaklaşmasıyla karakterize sitopatik etkinin ortaya çıkmasıyla birlikte, tek hücreli mikro-aspirasyon işlemine başlayın.

3. Tek Hücre Mikro-aspirasyonu

1. Konakçının hazırlanması
   NOT: Bu hazırlık, enfekte tek hücrelerin taze bir hücre desteğine salınması için yapılır.
   1. Kültürdeki amipleri 10 µg/mL vankomisin, 10 µg/mL imipenem, 20 µg/mL siprofloksasin, 20 µg/mL doksisiklin ve 20 µg/mL vorikonazol içeren bir antimikrobiyal ajan ile işleme tabi tutun. Bu karışım, bakteriyel ve fungal kontaminasyonları önlemek için kullanılır.
      NOT: İşlem, mikrobiyolojik güvenlik istasyonunun dışındaki bir tezgahta gerçekleştirilir. 15 adet Petri kabının her birine 1 x 10⁶ hücre/mL konsantrasyonda 2 mL amip ekleyin. Amiplerin yapışması için kültürü 30 °C'de 30 dk inkübe edin.
2. Limit dilüsyondan mikro-aspirasyon için kullanılacak Petri kabını şu kriterlere göre seçin: 1) fungal ve bakteriyel ajanlar tarafından herhangi bir görünür kontaminasyonun olmaması, 2) virüsler nedeniyle amiplerde sitopatik etkinin kanıtı ve 3) viral partiküllerin aspirasyonunu önlemek için amiplerin preliz ve yuvarlaklaşma evresinde olması.
3. Aşağıdaki malzemelerle bir çalışma istasyonu kurun (Şekil 1A,B):Mikrokapiler konumlandırmayı sağlayan mikromanipülatör;Hücreleri mikrokapilere aspire etmek ve salmak için kullanılan manuel basınç kontrol cihazı;Ters mikroskop;Tak-çalıştır motor modülleri;Kamera;Manipülasyonu görselleştirmek ve fotoğraf çekmek için bilgisayar modülü.
4. Bir mikrokapiler seçin (Şekil 1C).
   NOT: Hücrelerin boyutu, membranlarının yüzeylere deformasyonu ve yapışması ile hücresel motilite, mikro-aspirasyonun sorunsuz ilerlemesini etkileyebilir. Mikrokapiler çapı, hücre boyutlarına ve aspirasyon yöntemlerine bağlı olarak belirli hücre tiplerine göre hassas bir şekilde seçilebilir ve uyarlanabilir. Yuvarlaklaşmış bir amibi (çap ~10 µm) aspire etmek için 20 µm iç çaplı bir mikrokapiler kullanılmıştır. Bu, hücrenin iç konumunun korunmasını ve kolayca salınmasını sağlar.
5. Sistemi monte edin.
   1. Tutma sisteminin motorlu modül üzerindeki çalışma açısını 45°'ye sabitleyin.
   2. Önce tutma sistemi, ardından mikrokapiler üzerinde çift kurulum gerçekleştirin.
   3. Mikrokapilerden birkaç damla yağ geçirdikten sonra hücrelere odaklanın.
      NOT: Biyolojik uyumluluğa sahip mineral yağ, cihaz tarafından sağlanır.
   4. Montajı üretici önerilerini takip ederek tamamlayın.
6. Hücreleri klonlayın (Şekil 2A,B)
   1. 2 mL enfekte amip içeren Petri kabını mikroskobun altına yerleştirin.
   2. Önce hücrelere, ardından kültürün içine daldırılmış mikrokapilere odaklanın.
   3. Yuvarlaklaşmış tek bir hücre seçin ve mikrokapileri mikromanipülatöre yaklaştırın.
   4. Manuel basınç kontrolü ile hücreye hafif aspirasyon uygulayarak onu mikrokapilerin içine alın. Tek hücreyi ilk örnekten çıkarıp hücre desteğine salın, ardından 30 °C'de inkübe edin.
   5. Hücrelerin görünümünü gözlemlemek ve sitopatik etkinin ortaya çıkışını izlemek için ters optik mikroskop ile günlük gözlemler yapın.

Tablo 1: Kültür ortamlarının bileşimi

Sonuçlar

Şekil 1: Mikromanipülasyon malzemeleri. (A) Çalışma istasyonunun gerçek kurulumu. (B) Çalışma istasyonu bileşenlerinin şematik gösterimi. (C) Mikrokapiler tüpün şematik gösterimi.

Şekil 2: Mikro-aspirasyon basamakları. (A) Tek hücre izolasyon prosedürü (x40 yakınlaştırma). (B) Tek hücre aspirasyonunun farklı basamaklarının şematik gösterimi: 1) Hücrenin lokalizasyonu. 2) Hücrenin aspirasyonu. 3) Salım basamağı. Siyah oklar mikrokapileri, beyaz oklar ise tek hücreyi göstermektedir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Corning hücre kültürü flaskları 150 cm²	Sigma-aldrich	CLS430825	Kültür
Corning hücre kültürü flaskları 25 cm²	Sigma-aldrich	CLS430639	Kültür
Corning hücre kültürü flaskları 75 cm²	Sigma-aldrich	CLS430641	Kültür
DFC 425C kamera	LEICA	Unkown	Gözlem/İzleme
Eclipse TE2000-S İnvert Mikroskop	Nikon	Unkown	Gözlem/İzleme
Mikrokılcal boru 20 µm	Eppendorf	5175 107.004	Hücrelerin mikroaspirasyonu ve salınımı
Micromanipulator InjectMan NI2	Eppendorf	631-0210	Mikrokılcal boru konumlandırma
Petri kabı 35 mm	Ibidi	81158	Kültür/gözlem