Genomik Analiz İçin Tekil Virüs Partiküllerinin Floresan Tabanlı Ayrıştırılması

Özet

Kaynak: Zeigler Allen, L., et al. Isolation and Genome Analysis of Single Virions using 'Single Virus Genomics'. J. Vis. Exp. (2013).

Bu video, floresan tabanlı tespit ve hassas partikül sıralama yoluyla karışık popülasyonlardan genom içeren tekil virüslerin akış sitometrisi ile nasıl izole edildiğini ve ardından sonraki genomik karakterizasyon için agaroz gömme işleminin nasıl gerçekleştirildiğini göstermektedir.

Protokol

1. Viral Süspansiyonların Hazırlanması

Akış sitometrisi aracılığıyla tekil virionların izolasyonundan önce, fikse edilmemiş viral süspansiyonlar hazırlayın.

1. Final viral süspansiyonunun 0.1 μm filtrelenmiş TE (Tris-EDTA, pH 8) içerisinde olduğundan emin olarak, önceden belirlenmiş protokolleri kullanarak viral partikülleri izole edin. Kimyasal flokülasyon kullanan diğer yöntemler geliştirilmiş olsa da, Tanjansiyel Akış Filtrasyonu (TFF) yaklaşımlarının kullanılmasını öneririz.
2. Epifloresans 8-10 veya akış sitometrisi gibi yerleşik protokolleri kullanarak viral partikülleri sayın.
3. Viral süspansiyonu iki Eppendorf tüpüne paylaştırın (final hacminin 1,000 μl olması önerilir).

2. Akış Sitometrisi

1. Özel bir İleri Saçılım PMT (FSC PMT) ile donatılmış BD FACSAria II Akış Sitometresi kullanarak virüsleri ayırmak için, viral partikülleri şu çözeltide seyreltin: 0.1 μm-filtreli TE, pH 8.0 ile saniyede 200 olay (event) oranına uygun bir titreye seyrelterin^-1.
2. Sinyal-gürültü oranlarını maksimize etmek için eşikleri ayarlayın; örneğin, T4 ve lambda faj partikülleri içeren karışık bir topluluk için şunlar önerilir: FSC PMT 1.000 ve SSC 200.
3. Çalıştırın 100 μl -in / -un "boşluk" yalnızca 1) içeren örnekler 0.1 μm-filtrelenmiş TE ve 2) 0.1 μmfiltrelenmiş TE ve stok çözeltinin 1e-4 dilüsyonunda SybrGreen1 (10.000X).
4. Küçük bir alikotu (100 μl arka planı değerlendirmek için boyanmamış viral süspansiyondan küçük bir alikot (100 μl önerilir), ardından boyanmış viral süspansiyondan (stok çözeltinin 1e-4 dilüsyonunda SybrGreen1), her biri toplam 5.000 olaya ulaşana kadar viral partiküller çalıştırın. Bu işlem, konsantrasyonu kontrol etmek ve gerekirse sıralama öncesinde sıralama kapılarını (sorting gates) ayarlamak içindir. Viral partiküllerin merkezinde dar bir kapı kullanmanızı öneririz. Ayrıca, kapıları oluşturmak için SYBR Green ve FSC PMT grafiğini kullanıyoruz.
5. Ekleyin 5 μl 37 °C'ye soğutulmuş %1 düşük erime noktalı (LMP) agarozun (TBE tamponunda) 37 °C bir politetrafloroetilen (PTFE) mikroskop lamındaki (Electron Microscopy Sciences) her bir kuyuya.
6. Sıralanan viral partikülleri toplamak için PTFE mikroskop lamını akış sitometresine yerleştirin.
7. SYBR Green ile boyanmış viral partiküllerin doğrudan LMP agaroz içeren PTFE lam üzerine ayıklanmasına başlayın. Konfokal lazer taramalı mikroskopi (CSLM) sırasında virüslerin derinliğinin tespit edilmesine yardımcı olmak amacıyla, bazı kuyucuklarda 10 veya daha fazla olayın (viral partikülün) ayıklanmasını öneririz.
8. Sıralama tamamlandığında, lamı akış sitometresinden çıkarın ve ekleyin 5 μl 37 °C'ye soğutulmuş daha fazla LMP agaroz 37 °C her bir kuyuya, böylece viral partikül(leri) gömmüş olursunuz.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
1X TE tamponu	Invitrogen	12090-015
Tampon doygun fenol	Invitrogen	15513-039
LMP agaroz	Invitrogen	16520100
PTFE mikroskop lamı	Electron Microscopy Sciences	63430-04	24 kuyucuklu, 4 mm çapında
β-agaraz	New England Biolabs	M0392S