Çevresel Bir Su Örneğinden Dev Virüslerin Amip Tabanlı Zenginleştirilmesi

Özet

Kaynak: Bou Khalil, J. Y.,et al. A Rapid Strategy for the Isolation of New Faustoviruses from Environmental Samples Using Vermamoeba vermiformis. J. Vis. Exp. (2016)

Bu video, sonraki tespit ve analiz aşamalarını mümkün kılmak için, çevresel bir su örneğinden amip tabanlı ko-kültür kullanılarak dev virüslerin zenginleştirilmesini göstermektedir.

Protokol

1. Numune Toplama

1. Farklı ortamlardan ve bölgelerden 70 örnek toplayın. Bu durumda şunları kullanın: Saint Pierre de Meyzoargues köyünden (Fransa) 5 kirli su örneği, Marsilya'daki (Fransa) Parc Borély gölünden 15 örnek; Marsilya'daki (Fransa) Samena kayalık girişlerinden sedimentli 15 deniz suyu örneği, Alpler'den (Fransa) 25 nehir suyu örneği ve son olarak La Ciotat'tan (Fransa) kanalizasyondan 10 örnek.
2. İnokülasyondan önce, örnekleri herhangi bir işlem uygulamadan oda sıcaklığında bir dakika boyunca homojenizasyon için vortexleyin.

2. İzolasyon Prosedürü

1. Kör Kültür Prosedürleri için Konak Hazırlığı ve Numune İnokülasyonu
   1. Ko-kültür için hücre desteği olarak Vermamoeba vermiformis (suş CDC19) kullanın.
   2. Amebaları 28 °C'de, 30 ml proteaz-pepton-maya özütü-glikoz besiyeri (PYG) içeren 75 cm² hücre kültürü flaskında tutun. Lütfen PYG bileşimini Tablo 1'den kontrol edin.
      NOT: 48 saat sonra amebalar, sayım lamları (örneğin Kovaslides) kullanılarak normal sayım ile kantifiye edilir.
   3. Hücreleri 5 x 10⁵ ila 10⁶ hücre/ml konsantrasyonda hasat edin ve amebaları 720 x g'de 10 dk santrifüj ederek çöktürün.
   4. Süpernatantı aspirasyonla uzaklaştırın ve ameba pelletini 30 ml steril Page ameba salini (PAS) içinde (Tablo 1) yeniden süspanse edin. Bu durulama prosedürünü tekrarlayın.
   5. Amebaları, yaklaşık 10⁶ ameba/ml konsantrasyonda, antibiyotik ve antifungal karışımı içeren 30 ml açlık besiyerinde yeniden süspanse edin. Açlık besiyeri, amebanın kiste dönüşmeden veya çoğalmadan hayatta kalmasını sağlayan bir hayatta kalma besiyeridir. Bileşimi Tablo 1'den kontrol edin.
      NOT: Antimikrobiyal ajan karışımı 10 µg/ml vankomisin, 10 µg/ml imipenem, 20 µg/ml siprofloksasin, 20 µg/ml doksisiklin ve 20 µg/ml vorikonazol içeriyordu. Bu karışım, viral çoğalmayı azaltabilecek veya değiştirebilecek bakteriyel ve fungal kontaminasyonu azaltmaya hizmet etmiştir.
   6. Her numuneden 25 µl'yi, ameba adezyonunu destekleyen düz tabanlı 96 kuyucuklu plakadaki 200 µl ameba tek katmanının üzerine doğrudan inoküle edin ve nemli bir ortamda (nemli ortam, buharlaşmayı önlemek için plaka içeren torbanın içine ıslak bir kompres yerleştirilmesinden oluşur) 30 °C'de inkübe edin. Bu, primo-kültürdür. İki kuyucuktaki amebaları herhangi bir numune inokülasyonu yapmadan bırakın; bunlar negatif kontrol olarak işlev görür. Bu primo-kültürü üç gün boyunca inkübe edin.
   7. İlk inokülasyondan üç gün sonra, herhangi bir mikroskobik gözlem yapmadan, primo-kültür plağını yukarıda açıklandığı gibi taze amebalar üzerinde sub-kültür yapın. Yeni plakayı primo-kültür ile aynı koşullar altında üç gün boyunca inkübe edin.
   8. Bu üç günlük inkübasyondan sonra, final kültürü primo- ve sub-kültür ile aynı şekilde gerçekleştirin. Final kültürü iki gün boyunca inkübe edin. Ardından deteksiyona geçin.

Tablo 1. Çözelti tarifleri

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Proteaz-pepton-maya özütü-glukoz (PYG) besiyeri, Page amip salini (PAS), Açlık besiyeri	Kurum içi laboratuvar üretimi	Marseille URMITE	x
Amip suşu CDC-19	ATCC	France	50237
Plakalar	Cellstar	France	655180
Erlenmayerler	SARSTEDT	Germany	833911
Ultrasantrifüj Sorval WX 80	Thermo scientific	France	9102448