Enfeksiyöz Hepatit C Virüsünün Floresan Mikroskopi ile Kantifikasyonu

Özet

Kaynak: Ren, S., et al. A Protocol for Analyzing Hepatitis C Virus Replication. J. Vis. Exp. (2014)

Bu video, hücre kültüründeki enfeksiyöz Hepatit C virüsünü nicelleştirmek için kullanılan floresan odak analizini göstermektedir. Videoda, viral süpernatantın seri dilüsyonu, hepatoma hücrelerinin enfeksiyonu ve antikor tabanlı floresan mikroskobu kullanılarak viral replikasyon bölgelerinin tespiti gösterilmektedir.

Protokol

1. Virüs Titresinin Ölçülmesi

1. 96 kuyucuklu bir plaka kullanarak, naive Huh-7.5.1 hücrelerini kuyucuk başına yaklaşık 3 x 10³ hücre olacak şekilde ekiniz. Ertesi gün, Hepatit C virüsü (HCV) RNA-transfekte edilmiş hücrelerden elde edilen hücresiz kültür süpernatantının büyüme ortamı ile 10 katlı seri dilüsyonlarını yapınız ve Huh-7.5.1 hücrelerine üç paralel olacak şekilde inoküle ediniz.
2. Enfeksiyondan 72 saat sonra hücreleri metanol ile ( -20 ºC'de 30 dk boyunca) fikse ediniz ve HCV NS5A proteini için immün boyama yapınız.
3. Hücreleri üç kez PBS ile yıkayınız ve IFA bloklama tamponu ile bloklayınız.
4. Tavşan poliklonal anti-NS5A primer antikoru veya fare monoklonal anti-dsRNA antikoru J2'yi 1:200 dilüsyonda (1 μg/ml) kullanınız ve 4 ºC'de 5 saatten gece boyunca inkübe ediniz.
5. Primer antikor uygulamasından sonra hücreleri üç kez PBS ile yıkayınız.
6. Keçi anti-tavşan IgG-488 poliklonal sekonder antikoru veya keçi anti-fare IgG-594 poliklonal sekonder antikoru 1:1,000 dilüsyonda (1 μg/ml) ekleyiniz ve oda sıcaklığında 1 saat inkübe ediniz.
7. Hücreleri üç kez PBS ile yıkayınız ve floresan mikroskop kullanarak görüntüleyiniz.
8. NS5A pozitif odakları saymak için en yüksek dilüsyonu kullanınız ve mililitre başına ortalama odak oluşturucu birim (FFU) sayısını hesaplayınız. HCV titresi için Şekil 1'e bakınız.

Sonuçlar

Şekil 1. Vahşi tip HCV'nin enfektivitesinin incelenmesi ve virüs titresinin ölçülmesi. A) Enfeksiyon çalışmaları için naive Huh-7.5.1 hücreleri kullanıldı. HCV RNA transfeksiyonundan sonraki 48 ve 96. saatlerde (hpt) toplanan hücre dışı süpernatanlar, 10 katlık seri dilüsyona tabi tutuldu ve 96 kuyucuklu bir plaktaki hücrelere üç tekrarlı olarak eklendi. Enfeksiyondan 72 saat sonra hücreler fikse edildi ve HCV NS5A proteini için immün boyama yapıldı. NS5A pozitif boyanma (kırmızı) gösteren hücreler virüsle enfekte olmuştur. Foci Forming Unit (FFU) değerlendirmesi için, en yüksek dilüsyondaki pozitif odakların sayısı belirlendi. Temsili görüntü panelleri gösterilmiştir (Ölçek çubuğu 100 μm). B) Mililitre başına FFU cinsinden viral titre ortalama değerleri ve standart sapmaları grafikte gösterilmiştir. Polimeraz null mutant enfeksiyöz partiküller üretmemiştir. WT: vahşi tip; Pol-: Polimeraz null.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)	Fisher Scientific	10-017-CV
Huh-7.5.1	The Scripps Research Institute		Hücre hattı, The Scripps Research Institute ve Cedars-Sinai Medical Center arasında imzalanan MTA kapsamında Dr. Francis Chisari tarafından Dr. Arumugaswami'ye nezaketle sağlanmıştır
Mouse monoclonal anti-dsRNA antibody J2	English & Scientific Consulting Kft.	10010200
Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488	Life Technologies	A11008
Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 594	Life Technologies	A11020